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1. DNA中的中的DNase,蛋白,RNA, SDS ,EDTA,酚, 中的 ,蛋白, , , 氯仿和乙醇等
杂质都会影响酶切效果. 氯仿和乙醇等杂质都会影响酶切效果. 2. DNA中的杂中的杂DNA,蛋白可与非专一性结合使酶活中的杂 ,蛋白可与RE非专一性结合使
酶活性降低,另外杂DNA 也竞争酶的切口,往往造成切不也竞争酶的切口, 性降低,另外杂动. 3. DNA中的盐离子(如Mn2+,Cu2+,Co2+和Zn2+等) 中的盐离子( 中的盐离子与有机溶剂(如酚,氯仿和乙醇等) 与有机溶剂(如酚,氯仿和乙醇等)都可抑制限制酶的活性或使限制酶失活或造成DNA切不动或使限制酶的活性或使限制酶失活或造成切不动或使限制酶切割一些非特异序列(*活性活性) 切割一些非特异序列(*活性).
分子克隆
个体克隆多莉羊的克隆。
实验七、DNA的酶切、连接限制性核酸内切酶可以识别并附着特定的DNA序列，并对每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割，使DNA双链产生平末端或黏性末端。
DNA连接酶能连接DNA链中3’-OH末端和5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。
DNA连接酶的催化作用需要消耗能量。
1、酶切反应DNA样品：PCR纯化产物、空载体pQE30； 内切酶：Bam HⅠ、Hin dⅢ；反应体系：50μL。
酶活性1 μl Bam HⅠ（QuickCut）限制酶在50μl的反应体系中，在30℃条件下，经过5 min反应，可将1μgλDNA 完全消化。
37℃反应也表现出相同的酶活性，但不如30℃时稳定。
1 μl Hin dⅢ（QuickCut）限制酶在50μl的反应体系中，在37℃条件下，经过5 min反应，可将1μgλDNA 完全消化。
50μL反应体系ddH2O补至50μl10×QuickCut Green5uLBufferDNA（pQE30、EGFP）200ngQuickCut Bam H I1uLQuickCut Hin dⅢ1uL注：本实验消化约5μg DNA样品，按实际浓度计算所用的体积。
分别对空质粒、EGFP进行酶切。
操作步骤1.按上表组分配制酶切反应液；2.用枪头轻轻混匀；3.在37℃保湿孵育30min；4. 1.2%琼脂糖凝胶电泳20min，使用QuickCut GreenBuffer可直接上样；5.进行胶回收，回收产物置于-20℃冰箱保存，用于连接反应。
2、连接反应DNA样品：目的基因片段、空载体pQE30；（经双酶切并回收纯化）连接酶：T4 DNA连接酶；反应体系：20μL。
20μL反应体系ddH2O补至20μL 10×ligation buffer2uL载体DNA（pQE30）50ng目的DNA片段（EGFP）33ngT4 DNA Ligase (350U/μl)1uL注：载体和目的基因的摩尔比为1:3，50ng/3.4kb : 33ng/0.72kb = 14.7 : 45.8 ≈ 1:3操作步骤1.按上表组分配制酶切反应液；2.用枪头轻轻混匀；3.在16℃保湿孵育3h；（可在PCR仪里进行）4.连接产物由值日生放置于-20℃冰箱保存，用于转化实验。
DNA的限制性内切酶酶切分析DNA限制性内切酶酶切分析（restriction enzyme digestion analysis）是一种常用的实验方法，用于分析DNA片段的长度及其在不同DNA样本中的存在与否。
本文将介绍DNA限制性内切酶的定义和分类、酶切分析的原理、实验步骤和结果的分析等内容。
DNA限制性内切酶（restriction enzyme）是一种能够识别特定的DNA序列并酶切它们的酶类。
它的发现和应用让分子生物学和遗传学研究取得了重要的突破。
限制性内切酶按照它们识别的DNA序列和酶切的方式可以分为以下几类：1. 四切酶（Type I）：这类酶不仅有切割DNA的酶活性，还有甲基转移酶活性。
它们通常是多亚基复合物，需同时与子基的甲基转移酶活性合作。
2. 六切酶（Type II）：这类酶是最常用的限制性内切酶，它们能够识别特定的DNA序列，并在识别序列中特定的位置切割DNA链。
这类酶可以以精确的方式酶切DNA，生成具有粘性末端或平滑末端的DNA片段。
3. 四切酶（Type III）：这类酶也是多亚基复合物，通常需要其中一种辅助因子才能发挥酶切活性。
4. 五切酶（Type IV）：这类酶的酶切方式和高度特异性尚不清楚。
在酶切分析实验中，我们通常选用能够产生可检测到的DNA片段的限制性内切酶进行反应。
实验步骤如下：1.提取DNA样本：从要分析的细胞或组织中提取总DNA。
2. 选择限制性内切酶：根据需求选择一种适合的限制性内切酶。
常用的限制性内切酶有EcoRI、HindIII、BamHI等。
3.DNA酶切反应体系的设置：配置适当的酶切反应缓冲液，加入所选的限制性内切酶和总DNA，进行适当的搅拌反应。
4.酶切反应的条件调整：根据所选酶切酶的最佳工作条件进行反应温度、反应时间等参数的调整。
5.停止酶切反应：加入适当的制动剂（如酶切反应停止缓冲液）终止酶切反应。
6.扩增和可视化：对酶切后的DNA样品进行聚合酶链反应（PCR）扩增或直接进行凝胶电泳检测，以确定DNA片段的长度和存在与否。
DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制课件 (一)DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制课件是高中生物教育中的必修内容，旨在让学生了解DNA限制酶是如何起作用的，以及如何使用限制酶谱绘制技术来区分和比较DNA分子之间的差异。
以下是详细讲解：一、DNA限制酶切反应1.1 什么是DNA限制酶DNA限制酶是一类天然存在于细菌和其他微生物中的酶。
它们可以识别特定的DNA序列，并在这些序列的两侧切断DNA分子，形成一系列自然的“限制性片段”。
1.2 DNA限制酶如何切割DNA分子DNA限制酶可以识别并切割DNA分子中的双链DNA，主要有以下几个步骤：（1）DNA限制酶通过“扫描”DNA分子，找到需要切断的目标序列。
（2）通过与DNA分子中的靶标序列特异性配对，DNA限制酶在靶标序列两侧同时切割，形成两个粘性末端或平滑末端。
（3）粘性末端的特点是其中一条链比另一条链长出几个碱基，这样就使其容易与相同限制酶切割产生的其他粘性末端进行连接。
1.3DNA限制酶的分类和应用DNA限制酶可以根据它们切割的靶标DNA序列进行分类。
这些靶标序列通常是在酶名称后面标注的第一个字母缩写。
不同的限制酶会切割不同的DNA序列，因此它们具有不同的识别和切割模式。
这种特异性可以使DNA限制酶被用于许多生物学应用中，例如：DNA序列分析，DNA重组，基因克隆等。
二、限制酶谱绘制课件2.1什么是限制酶谱？限制酶谱是对于单个DNA分子进行DNA限制酶切割反应，产生的一系列限制性片段进行分析的过程。
限制酶谱可以用来鉴定和区分不同的DNA分子，例如：同源染色体，嵌合体，插入序列，基因家族等。
2.2 如何绘制限制酶谱？绘制限制酶谱需要识别出DNA限制酶在目标DNA中产生的限制性片段，并构建一个分子量标准库，将每个片段的长度与相应的分子量进行对应。
限制酶谱可以使用凝胶电泳技术进行分析，并通过可见光或放射性同位素的荧光成像来观察分子量标准库中的各个DNA片段。
