4细胞化学染色检验

3、分类及诊断标准⑴、M1 急性髓细胞白血病未成熟型1.血象:贫血显著，外周血可见幼红细胞，白细胞总数升高。

血片中以原始粒细胞为主，少数患者可无或极少幼稚粒细胞出现。

血小板中度到重度减少。

2.骨髓象:骨髓增生极度活跃或明显活跃，少数病例可增生活跃甚至减低。

骨髓中原始粒细胞大于90%(NEC)，白血病细胞内可见Auer 小体，幼红细胞及巨核细胞明显减少，淋巴细胞也减少。

3.细胞化学染色:POX染色至少有3%原粒细胞POX阳性。

⑵、M2 急性髓细胞白血病部分成熟型1.血象:贫血显著，白细胞中度升高和M1相似，以原始粒细胞及早幼粒细胞为主。

血小板中度到重度减少。

2.骨髓象:骨髓增生极度活跃或明显活跃，骨髓中原始粒细胞占30%~89%(非红系)，早幼粒、中幼粒和成熟粒细胞大于10%，白血病细胞内可见Auer小体，幼红细胞及巨核细胞明显减少，此型白血病细胞的特征是形态变异及核质发育不平衡。

3.细胞化学染色(1)P0X与SB染色: 均呈阳性反应。

(2)PAS染色:原粒呈阴性反应，早幼粒细胞为弱阳性反应。

(3)中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP):成熟中性粒细胞的NAP活性明显降低，甚至消失。

(4)特异性和非特异性酯酶染色:氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色呈阳性反应。

醋酸AS-D萘酚酯酶染色(AS-D-NAE)可呈阳性反应，但强度较弱，且不被氟化钠抑制。

(5)Phi(ф)小体染色:原始和幼稚粒细胞内出现Phi(ф)小体。

(6)染色体及分子生物学检验:特异性染色体重排t(6;9)约见于1%的AML，主要为本型。

4.免疫学检验:表达髓系抗原，可有原始细胞和干细胞相关抗原，CD34、HLA- DR、CD13、CD33和CD57阳性。

5.染色体和分子生物学检验:t(8;21)(q22;q22)易位是M2b的一种常见非随机染色体重排，其检出率高达90%。

AML1基因重排可作为本病基因诊断的标志。

⑶、M3急性早幼粒细胞白血病1.血象:血红蛋白及红细胞数呈轻度到中度减少，部分病例为重度减少。

细胞化学染色细胞化学染色2011年03月02日老三届极品居认真做事，低调做人。

记住该记住的，忘记该忘记的，改变能改变的，接受不能改变的。

一、概述细胞化学是组织学的一个分支，是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分,及其定位、定量及代谢功能状态的学科。

在细胞形态学的基础上，运用化学反应的原理对血细胞内的各种生化组成及其代谢产物（酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。

细胞化学染色临床上主要用于：①辅助判断白血病的细胞类型。

白血病的诊断以形态学为基础，但有时仅采用瑞式染色是难以判断白血病细胞的类型的。

不同的细胞系列，其所含的化学物质成分、含量及分布各不相同，随着细胞的分化阶段及病理生理状态变化，这些物质的含量也会发生相应改变。

因此根据细胞化学染色结果的不同，可推断细胞的所属系列。

因此临床上细胞化学染色成为辅助诊断白血病必要的、有力的手段。

②其他血液系统疾病的诊断和鉴别诊断。

在病理情况下，血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变，据此可以辅助疾病的鉴别诊断。

如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。

③观察疾病的疗效和预后。

当病理状况纠正后，血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变。

④发病机制的研究。

细胞化学染色的基本步骤为固定、显示及复染。

1、固定为了保持细胞结构及化学成分的不变，需要对细胞进行固定。

根据染色的成分不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖等变成不溶性物质。

固定的方法有物理法和化学法，临床常用化学法固定。

物理法包括干燥和火焰固定，化学法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定。

采用蒸气或液体固定。

（1）蒸气固定：甲醛是常用的固定剂，极易挥发、氧化，常用40％甲醛蒸气固定。

方法为在封闭的玻璃器皿中加入40％甲醛，将涂片血膜朝下，固定5～10分钟。

（2）液体固定：将涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中，也可将两种或两种以上固定液混合，如10％甲醛甲醇液，甲醛丙酮液等。

细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。

细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。

细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。

一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。

骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。

以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。

（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。

（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。

（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。

（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。

“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。

4血细胞化学染色（2）铁染色
1，原理：幼稚红细胞内的铁和细胞外的含铁血黄素，与酸性亚铁氰化钾生成蓝色颗粒沉淀（亚铁氰化铁）。

2，细胞内铁的染色：观察100个中幼红、晚幼红，计100个幼红细胞中所见到的铁粒幼红C占的%。

3，铁粒幼红细胞：指内含有蓝色铁颗粒的幼稚红细胞。

据铁颗粒多少可分为4个型别和环形铁粒幼红C。

I型为多见，
环形铁粒幼红C：指幼红细胞胞质中出现蓝色铁颗粒的数量≥6个，并围绕核周50%以上者叫….
铁粒红细胞：指成熟红细胞中出现铁颗粒者。

4，正常参考值：细胞外铁是（+）—（++）
铁粒幼RBC的阳性率是19—44%，I型多见，少有II型。

（Ret以外周中的IV型为主）
5，缺铁性贫血：骨髓外铁减少或消失；铁幼粒细胞%减少，有效治疗后，细胞外铁增加。

细胞内外铁都减少。

是铁缺乏。

6，铁粒幼贫血：有较多环形铁粒幼，铁粒幼也增多，可见铁粒红细胞。

细胞内外铁都增多。

是铁利用障碍。

新生儿的贫血分类标准：出生10天内：≤145g/L，
1个月以上：≤90g/L，
4个月以上：≤100g/L，
6个月到6岁：≤110g/L。

细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。

由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段,则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。

目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法,本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。

第一节培养细胞的常规检查和观察方法细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察,及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。

细胞常规检查观察的内容为:一、肉眼观察一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。

正常情况下,培养液pH介于7.2～7。

4之间，呈桃红色清亮透明。

加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着细胞生长时间的延长,细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。

在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH，会影响细胞的生长，甚至造成细胞退变死亡.所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代.一般更换培养液的时间，依营养物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。

培养液中加Hepes或用5％CO2温箱培养可使pH维持稳定,利于细胞生长。

用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物,使培养液变碱发红,只致使细胞难以生长，甚至死亡.细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。

贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。

悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染,也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现.二、显微镜观察生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。

相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。

若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱,细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落,有时细胞表面及周围出现丝絮状物.若细胞营养不良状况没有得到及时纠正,进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。

免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。

缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。

试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。

2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。

3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。

5、马上用荧光显微镜观看。

观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。

留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。

2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。

实验十二常用血细胞化学染色Cytochemistry stain for blood cells一、过氧化物酶染色染色原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。

联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。

试剂器材1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。

2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。

3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。

4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。

5．瑞氏(Wright)染色液。

6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。

操作步骤1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。

2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。

3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。

4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。

注意事顶1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。

2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。

3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。

涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。

若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。

4．染色液pH应为5.5。

常用的五种细胞化学染色方法一、细胞化学染色方法概述细胞化学染色是生物学和医学研究中常用的技术手段，通过对细胞内各种化学成分的染色，可以揭示细胞的结构、功能以及病变过程。

根据染色原理和目的的不同，细胞化学染色方法有多种分类。

本文将介绍五种常用的细胞化学染色方法，分别是：吉姆萨染色、瑞氏染色、巴氏染色、苏木素-伊红染色和福尔根染色。

二、常用的五种细胞化学染色方法1.吉姆萨染色吉姆萨染色是用于显示细胞内蛋白质和核糖体的方法。

该方法使用含有天青、伊红、酸性品红等染料的吉姆萨染液对细胞进行处理，使蛋白质和核糖体呈现紫红色或蓝紫色。

吉姆萨染色在免疫学和寄生虫学等领域有广泛应用。

2.瑞氏染色瑞氏染色是一种用于显示细胞内颗粒物质的染色方法，如细胞内酶、核酸等。

该方法使用含有伊红和天青染料的瑞氏染液对细胞进行处理，使颗粒物质呈现蓝紫色或红色。

瑞氏染色常用于病理学和血液学中的骨髓涂片检查。

3.巴氏染色巴氏染色是一种用于显示细胞内糖原的染色方法。

该方法使用含有苏丹III 或苏丹IV染料的巴氏染液对细胞进行处理，使糖原呈现红色或橙色。

巴氏染色在妇科和肿瘤学等领域有重要应用，常用于检查宫颈脱落细胞中的糖原含量。

4.苏木素-伊红染色苏木素-伊红染色是一种显示细胞核和细胞质的染色方法。

该方法使用含有苏木素和伊红染料的染液对细胞进行处理，使细胞核呈现蓝色，细胞质呈现红色或橘黄色。

苏木素-伊红染色在病理学中广泛用于组织切片的诊断。

5.福尔根染色福尔根染色是一种用于显示DNA的染色方法。

该方法使用含有品红和苦味酸的福尔根染液对细胞进行处理，使DNA呈现蓝色。

福尔根染色在遗传学和肿瘤学研究中常用作显示肿瘤细胞的DNA含量。

三、结论细胞化学染色在生物学和医学研究中具有重要价值，有助于揭示细胞的结构、功能和病变过程。

常用的五种细胞化学染色方法各有其特点和适用范围，可以根据研究目的和需求选择适合的方法。

这些常用的细胞化学染色方法在实验操作和试剂选择等方面有一定的标准和要求，熟练掌握这些方法有助于提高实验结果的可靠性和准确性。