游离DNA的染色体水平拷贝数分析流程-用户手册

DNA测序技术的操作方法与注意事项DNA测序技术是现代生物学研究中最为重要的技术之一。

它通过读取DNA序列，揭示了生命的遗传密码，为疾病研究、基因工程、进化生物学等领域提供了强有力的工具。

然而，要想获得高质量的DNA测序结果，操作方法与注意事项是不可忽视的。

一、操作方法1. DNA提取：DNA提取是测序的第一步，要确保提取到足够纯净、高质量的DNA样品。

操作过程中需要注意以下几点：a. 样品的选择：样品可能是细菌、动植物组织、人类血液等不同类型。

不同类型的DNA提取方法有所不同，需要根据样品的特点选择适当的提取方法。

b. 样品的保存：为了避免DNA降解，样品在提取前应得到适当的保存。

冷冻保存是常用的方法。

c. 提取试剂的选择：市面上有多种DNA提取试剂盒可供选择，根据实验需要选择合适的试剂。

d. 操作规范：注意无菌操作，避免外源DNA污染。

同时，注意各个步骤的时间控制和温度控制，以保证提取过程的高效和准确。

2. PCR扩增：PCR扩增是测序前的重要步骤，通过反复复制目标DNA片段，进行扩增并提高检测的灵敏度。

在PCR扩增过程中需要注意以下几点：a. 引物的设计：PCR扩增需要引物与目标DNA序列互补，引物设计应合理，尽量避免非特异性扩增。

b. 影响PCR反应的参数：反应体系中的温度、时间、酶浓度等参数需要精确控制，不同的目标DNA可能需要不同的PCR条件。

c. 循环数的选择：循环数太少可能导致扩增产物过少，循环数太多可能引起非特异扩增，需要根据实际情况选择合适的循环数。

3. PCR产物纯化：PCR产物纯化是为了去除引物、引物二聚体等对测序反应的干扰物质。

在PCR产物纯化过程中需要注意以下几点：a. 使用PCR纯化试剂盒：市面上有多种PCR产物纯化试剂盒可供选择，根据实验需要选择合适的试剂盒。

b. 操作规范：注意洗涤缓冲液的使用和洗涤次数的控制，以确保纯化效果。

4. DNA测序反应：将纯化后的PCR产物进行测序反应前，需要注意以下几点：a. 反应体系的准备：反应体系中需要添加适量的测序引物、缓冲液和酶，同时确保反应体系的最终体积和比例准确。

DNA提取标准操作规程1. 目的：规范不同检材的DNA提取操作程序，确保DNA质量，保证STR分型结果准确性。

2. 原理：Chelex-100 是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。

在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA 分离。

磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。

反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。

3. 操作者：具有法医物证检验资格的广西区妇幼司法鉴定所技术人员。

4. 标本：5％EDTA抗凝全血、8-10ml胎儿羊水、5％EDTA抗凝脐血、FTA纸血斑、口腔拭子、5-10根带毛囊的毛发、绒毛细胞。

5 试剂：5.1 试剂的厂家及规格：5.1.1 DNA抽提试剂 Chelex-100 伯乐公司（Bio-Rad Laboratories, Inc. CA U.S.A）。

5.1.2 DNA抽提试剂 Promega PP18或PP21 DNA System抽提试剂盒。

5.1.3 DNA抽提试剂口腔棉签制备基因组DNA试剂盒（G&T，U.S.A）5.1.4 无水乙醇分析纯5.1.5 异丙醇分析纯5.1.6 无菌的超纯水由实验室技术人员制备。

5.2 试剂的配制：5.2.1 5％Chelex-100的配制：称取5克粉状Chelex-100于试剂瓶中，加入灭过菌的超纯水至100ml。

5.2.2 灭菌超纯水的制备：用干净的试剂瓶装超纯水1升左右，经121℃灭菌30分。

6 仪器及设备：6.1 生物安全柜。

6.2 高速离心机。

6.3 超速冷冻离心机。

版本号：11/2020游离DNA提取试剂盒（柱式法）说明书【产品名称】通用名称：核酸提取或纯化试剂商品名称：游离DNA 提取试剂盒（柱式法）英文名称：CWhipro Circulating Nucleic Acid Kit 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的血清、血浆、淋巴液等无细胞体液中提取游离DNA 。

得到的游离DNA 用于PCR 、荧光定量PCR 和二代测序等分子生物学实验。

【预期用途】 本试剂盒采用可以特异性结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，样品裂解后，游离DNA 在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐、高pH 值时游离DNA 从硅胶膜上洗脱下来。

本品可以处理0.1-1 ml 的液体样本，配置的高效微量吸附柱洗脱体积可低至20 μl 。

纯化的DNA 产量高、质量好，最大限度去除蛋白、色素、脂类及其他抑制物，游离DNA 得率与样品的类型，储存条件、时间以及个体间差异有很大关系。

【检验原理】50次/盒；200次/盒【包装规格】【主要组成成分】50次/盒200次/盒试剂名称规格数量规格数量裂解缓冲液45ml/瓶1瓶200ml/瓶1瓶结合缓冲液（浓缩液）60 ml/瓶1瓶240ml/瓶1瓶漂洗缓冲液1（浓缩液）13 ml/瓶1瓶52ml/瓶1瓶漂洗缓冲液2（浓缩液）15ml/瓶1瓶60ml/瓶1瓶洗脱缓冲液10ml/瓶1瓶30ml/瓶1瓶蛋白酶K100mg/支1支400mg/瓶1瓶蛋白酶K保存液5ml/支1支20ml/瓶1瓶吸附柱50个/包1包50个/包4包收集管50个/包1包50个/包4包需要实验者自行准备的试剂：无水乙醇、异丙醇。

【储存条件及有效期】吸附柱2-8℃保存，其余组分0-35℃保存，有效期12个月。

可在0-40℃运输，运输时间建议不超过7天。

【样本要求】1．适用标本类型：新鲜或冷冻的血清、血浆、淋巴液等无细胞体液。

2．标本处理与保存：样本应避免反复冻融，否则影响提取的得率和质量。

3．样本运输：应采用冰壶或者泡沫箱加冰或干冰密封运输。

附件1孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断是应用高通量基因测序等分子遗传技术检测孕期母体外周血中胎儿游离DNA片段，以评估胎儿常见染色体非整倍体异常风险。

为规范该类技术的临床应用，制订本规范。

本规范主要包括开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术的基本要求、适用范围、临床服务流程、检测技术流程以及质量控制指标等内容。

第一部分基本要求一、机构要求（一）开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断的医疗机构应当获得产前诊断技术类《母婴保健技术服务执业许可证》。

（二）开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断采血服务的医疗机构(以下简称采血机构)应当为有资质的产前筛查或产前诊断机构。

开展采血服务的产前筛查机构须与产前诊断机构建立合作关系，并向省级卫生计生行政部门备案。

（三）开展孕妇外周血胎儿游离DNA实验室检测的医疗机构（以下简称检测机构）应当具备临床基因扩增检验实验室资质，严格遵守《医疗机构临床实验室管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》等相关规定，相应检验项目应当接受国家卫生计生委临床检验中心组织的室间质量评价。

二、人员要求（一）从事孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断的专业技术人员应当按照《产前诊断技术管理办法》要求取得相应资质。

（二）从事孕妇外周血胎儿游离DNA产前检测的实验室人员应当经过省级以上卫生计生行政部门组织的临床基因扩增检验技术培训，并获得培训合格证书。

三、设备试剂要求（一）在具备细胞遗传学实验诊断设备的基础上，同时具备开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断相应的主要设备，包括DNA提取设备、PCR仪、高通量基因测序仪或其他分子检测设备等。

设备的种类、数量应当与实际开展检测项目及检测量相匹配。

（二）设备、试剂和数据分析软件应当符合《医疗器械监督管理条例》和《医疗器械注册管理办法》等相关规定，经过食品药品监督管理部门批准注册。

染色体微阵列分析报告引言染色体微阵列是一种用于研究基因组改变的方法，它可以同时分析多个基因座的拷贝数变异。

本文档将介绍染色体微阵列分析的原理、实验流程以及结果分析。

方法样本准备从病人体内获取染色体样本，例如血液、组织等，进行细胞培养和染色体提取工作。

微阵列实验将提取得到的染色体样本进行荧光标记，并与已知引物探针进行杂交。

然后使用染色体微阵列芯片进行读取和扫描，获取到每个基因座的信号强度。

数据分析根据信号强度，使用专门的数据分析软件对微阵列数据进行处理和分析。

常见的分析方法包括拷贝数变异分析、基因座关联分析等。

结果拷贝数变异分析根据微阵列数据，可以获得每个基因座的信号强度，从而推断拷贝数变异的情况。

拷贝数增加或减少可能与一些疾病相关。

基因座关联分析通过比较不同基因座之间的信号强度，可以发现它们之间的关联性。

这有助于理解基因座之间的相互作用和调控机制。

结果解读根据拷贝数变异分析和基因座关联分析的结果，可以得出一些结论。

例如，某个基因座的拷贝数增加与某种疾病的发病风险增加有关等。

结论染色体微阵列是一种有效的分析基因组改变的方法。

通过对微阵列数据的处理和分析，可以获得有关基因座的拷贝数变异和关联性的重要信息。

这对于研究疾病的发病机制和个体的遗传特征具有重要意义。

参考文献： 1. Smith A, et al. (2005). Microarray analysis of human copy number variants. 2. Johnson B, et al. (2007). Association mapping in structured populations.。

血浆游离DNA提取标准操作规程1.目的：制定DNA提取标准操作规程，使尽可能多提取到血浆游离DNA。

2.适用范围：血浆提取。

3.术语及定义：无。

4.职责：4.1 文件编写：高通量实验室技术员。

4.2 文件审核：高通量实验室组长。

4.3 文件审批：实验室主任。

4.4 执行：高通量实验室的所有工作人员。

5.操作规程：5.1准备工作5.1.1紫外杀菌：打开超净工作台内的紫外灯，杀菌30 min，关闭紫外灯，打开抽风机，通风10 min。

5.1.2实验前准备：通风结束后，根据《实验室安全防护规程》中的相关规定，换好洁净服、洁净帽、防护镜等进入实验室；将恒温金属浴打开至56℃，将恒温水浴锅打开至60℃。

5.1.3准备物品：准备1.5 mL及2.0 mL的EP管，50mL离心管，96孔双面板，1000μL、200μL、100μL、20μL、和10μL移液枪和枪头，游离核酸提取试剂盒（离心柱法）。

5.1.4试剂准备及配制：5.1.4.1无水乙醇，异丙醇。

5.1.4.2每管Carrier RNA（干粉）中各加入1550μL的洗脱液（A VE），充分混匀，溶解。

-20℃保存（Carrier RNA为白色或半透明物质，请确保其完全溶解；反复冻融不可超过三次，可分装保存避免反复冻融）。

5.1.4.3每瓶AW1加入25mL的无水乙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。

5.1.4.4每瓶AW2加入30mL的无水乙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。

5.1.4.5每瓶ACB加入200mL的异丙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。

5.1.4.6 Buffer AL与Carrier RNA进行混合，配制成裂解工作液(现配现用)5.1.5真空泵准备依次将Luer slot of the QIAvac 24 Plus (closed with luer plug)、开关阀、连接器、吸附柱、扩展管装到真空泵底座上（装紧以防止漏气）。

5.2 DNA提取流程5.2.1在50mL的离心管内加入100μL的蛋白酶K。

DNA测序实验技术的使用教程与数据解读DNA测序，作为分子生物学中重要的实验技术之一，广泛应用于基因研究、疾病诊断以及进化等领域。

本文将介绍DNA测序实验技术的使用教程，并探讨如何解读测序数据。

一、DNA测序实验技术的使用教程1. 实验准备在进行DNA测序实验前，需要准备以下材料：待测序样本、DNA提取试剂盒、测序试剂盒、PCR仪、离心机等。

2. DNA提取首先，需要从待测序样本中提取DNA。

一般常用的DNA提取方法有酚-氯仿法和商业试剂盒法等。

在提取过程中，要注意避免DNA的污染，确保提取的DNA质量良好。

3. DNA扩增通过PCR技术对DNA进行扩增，以获得足够的DNA量。

根据不同的实验目的，选择不同的引物进行PCR扩增，如全基因组测序可以使用全基因组扩增引物，而目标基因测序则需要特定的引物。

4. DNA测序常用的DNA测序方法有Sanger测序和Next Generation Sequencing (NGS)测序。

Sanger测序适用于小规模的测序项目，而NGS测序则适用于大规模测序项目。

5. 数据处理进行DNA测序后，会得到一系列的测序数据。

这些原始数据需要进行质量控制、去除接头序列、提取有效序列等步骤。

可以使用一些常用的序列处理软件，如FASTQ Toolkit、Trimmomatic等。

6. 数据分析得到可靠的测序数据后，可以开始进行数据分析。

首先，可以使用一些基因组比对工具将测序数据与参考基因组进行比对，如Bowtie、BWA、STAR等。

然后，可以利用一些基因组浏览器软件对比对结果进行可视化，如IGV、UCSC Genome Browser等。

二、DNA测序数据解读1. SNP分析SNP (Single Nucleotide Polymorphism)是最常见的基因组变异形式之一。

通过对测序数据进行比对分析，可以鉴定出样本中的SNP位点，并进行进一步的功能注释。

2. Indel分析Indel (Insertion-Deletion)指的是DNA序列插入或缺失的变异形式。

拷贝数变异（CNV）人类基因组由23对染色体中的60亿个碱基（或核苷酸）组成。

正常人类基因组成分通常是以2个拷贝存在，分别来自父母。

拷贝数变异（CNV）是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的缺失和重复，是人类疾病的重要致病因素之一。

异常的DNA拷贝数变化（CNV）是许多人类疾病（如癌症、遗传性疾病、心血管疾病）的一种重要分子机制。

作为疾病的一项生物标志，染色体水平的缺失、扩增等变化已成为许多疾病研究的热点，然而传统的方法（比如G显带，FISH，CGH等）存在操作繁琐，分辨率低等问题，难以提供变异区段的具体信息。

CNV，即拷贝数变异，一般指长度为1kb到几个Mb基因组大片段的拷贝数复制、缺失。

CNV被定义为一段至少1kb大小DNA的拷贝数，与具有代表性的参考基因组拷贝数不同。

CNV在基因组中的存在形式主要有以下几种：2条同源染色体拷贝数同时出现缺失；1条同源染色体发生缺失，1条正常；1条同源染色体出现拷贝数重复，另1条正常；1条同源染色体出现缺失，另1条出现拷贝数重复；2条同源染色体同时出现拷贝数重复。

染色体拷贝数变异（CNV）检测：NIPT技术目前医院临床应用的为普通NIPT技术，商业上还有通过增加测序数据的升级版的NIPT产品（可以检测染色体微缺失/微重复和某些单基因病）。

对于NIPT提示的CNV可以分为两种：母源性CNV，就是母亲存在CNV（此时胎儿50%可能存在相同的CNV，50%可能不存在该CNV）；第二种，胎儿CNV。

母源性CNV的阳性预测值（PPV）接近100%，因为母源游离DNA占比90%，因此阳性预测值（PPV）很高就不足为奇。

但是不同的检测机构或者有些已发表文献，并不提示母源性CNV。

对于母源性CNV，胎儿无非两种情况，和母亲一样拥有同样的CNV，或不含有该CNV。

在临床咨询中，对于这种来源于母源或父源CNV，如果父母本身没有任何表型，胎儿本身也不存在超声结构异常，我们大多认为偏良性。

血浆游离dna定量测定方法
血浆游离DNA的定量测定方法主要包括以下步骤：
1. 样本采集：采集血液样本，离心分离出血浆，并取一定量的血浆用于后续检测。

2. DNA提取：利用特定的DNA提取试剂盒或吸附柱，从血浆中提取游离DNA。

这一步中，需要选择合适的DNA提取方法，以确保DNA的纯度和回收率。

3. 定量检测：利用荧光定量PCR（聚合酶链式反应）技术或数字PCR技术，对提取出的游离DNA进行定量检测。

这些技术可以根据DNA的浓度和扩
增情况，计算出血浆中游离DNA的含量。

4. 数据分析：对检测结果进行分析，计算出游离DNA的浓度或相对比例，并评估其与疾病或其他指标的相关性。

请注意，以上步骤仅为一般性描述，实际操作中可能因实验条件、仪器设备及试剂等不同而有所差异。

此外，为了确保检测结果的准确性和可靠性，建议在专业实验室进行血浆游离DNA定量测定，并遵循实验室的安全操作规范。

AFLP实验操作指南AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）是一种基因组DNA的指纹分析技术，通过PCR扩增DNA片段，并利用限制性内切酶消化DNA，然后使用特异引物扩增消化后的DNA片段，最后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物的长度差异，从而得到样品间的遗传多样性信息。

一、实验前准备1.获得研究对象的DNA样品。

2.购买AFLP实验所需的试剂和设备，包括PCR试剂盒、限制性内切酶、DNA聚合酶、聚丙烯酰胺凝胶电泳设备等。

3.根据实验需要设计合适的引物序列并订购。

二、DNA提取1.根据样品的特点选择合适的DNA提取方法，如CTAB法、酚/氯仿法等。

2.提取的DNA需经过质量检测，确保浓度和纯度。

三、限制性内切酶消化1.根据实验需要选择适当的限制性内切酶，并遵循其使用说明书中的操作要求。

2.准备两个PCR管，一个用于对照组胶样品，另一个用于实验组样品。

3.在每个PCR管中分别加入限制性内切酶、DNA样品、缓冲液和适量的水，混匀后进行酶切反应，酶切时间和温度根据限制性内切酶的要求进行调整。

四、连接接头的制备和连接反应1.根据实验需要设计并合成合适的连接接头，接头一般包括PCR引物序列和一段固定的序列。

2.制备连接反应的混合液，包括连接接头、连接酶、连接缓冲液和适量的水，混匀后加入限制性内切酶消化产物。

3.进行连接反应，反应温度和时间根据连接酶的要求进行调整。

4.连接反应后，可进行酶切反应以去除未连接的连接接头。

五、PCR扩增1.准备两组PCR反应体系，一组为对照组，另一组为实验组。

2.根据实验需要选取合适的扩增引物，对每个引物序列进行扩增反应。

3.准备PCR反应体系，包括PCR引物、扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和适量的水。

4.进行PCR扩增反应，反应温度和周期根据引物的要求进行调整。

5.扩增产物可以经过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，或者通过测量DNA浓度进行定量分析。

如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。

第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。

一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。

在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。

插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。

因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。

1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。

其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。

Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。

另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。

如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。

这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。

2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。

实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。

其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。

游离dna,mpss方法
游离DNA是指在细胞内或细胞外自由存在的DNA分子，不与蛋白质结合形成染色质或其他复合物。

在细胞内，游离DNA可能是由于细胞凋亡或细胞分裂时释放的碎片，也可能是细胞核内的DNA修复或复制过程中产生的中间产物。

在细胞外，游离DNA可以存在于体液中，例如血浆、尿液、唾液等，也可以存在于环境中，例如土壤或水体中。

MPSS（Massively Parallel Signature Sequencing）是一种高通量的基因表达分析方法，通过测定RNA序列来定量分析基因的表达水平。

该方法利用DNA微阵列或测序技术，将RNA转录本转化为短的签名序列，然后通过高通量测序技术进行测序，从而得到大量的基因表达信息。

MPSS方法具有高灵敏度、高通量和高分辨率的特点，能够对基因表达进行全面、准确的分析，广泛应用于基因功能研究、疾病诊断和药物研发等领域。

综上所述，游离DNA是指自由存在的DNA分子，而MPSS是一种高通量的基因表达分析方法，两者在分子生物学和基因组学研究中具有重要的应用意义。

对于游离DNA的研究，可以通过MPSS等方法
来分析其在细胞内外的产生、释放和功能，从而深入了解其在生物学过程中的作用和意义。

基于二代测序的早期肺腺癌血浆游离DNA的拷贝数目检测共3篇基于二代测序的早期肺腺癌血浆游离DNA的拷贝数目检测1基于二代测序的早期肺腺癌血浆游离DNA的拷贝数目检测肺癌是一种高度致死率的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位居全球前列。

目前，肺癌的早期筛查和诊断仍然是一个极具挑战性的领域。

随着技术的发展，越来越多的科学家研究并探索肺癌早期诊断的方法，其中最有前途的便是利用血浆游离DNA检测肿瘤标志物。

本文将探讨利用基于二代测序的早期肺腺癌血浆游离DNA的拷贝数目检测。

二代测序技术（Next generation sequencing，NGS）在基因组学和生物信息学领域中发挥着重要的作用。

利用NGS技术对DNA进行定量检测，不仅可以快速、准确地获取DNA序列信息，还可以获得大量的序列数据，为肺癌早期诊断和治疗提供了新的思路和方法。

在肺癌早期诊断中，血浆游离DNA的拷贝数目检测技术已经成为了一个非常有前途的研究方向。

这种方法可以通过检测血浆游离DNA中是否存在肿瘤标志物，来检验是否有早期肺腺癌的出现。

血浆游离DNA的拷贝数目检测技术，采用NGS技术来检测血浆中的DNA序列，在此之前需要进行血浆样本的处理。

血浆样品的处理具有必要性，以减少血细胞DNA对检测结果的干扰。

已有研究表明，DNA序列中的肿瘤标志物与早期肺癌有着密切关系，如TP53、EGFR和KRAS等。

可以通过改变用于放大DNA序列的引物来检测出这些标志序列。

此外，也可以使用PCR技术来扩增一定数量的DNA序列，并通过相应的软件（如Qubit）来精确定量，并确定肿瘤标志物的存在，来证明早期肺癌。

利用血浆游离DNA的拷贝数目检测技术的优势在于可以通过无创的方法进行肿瘤标志物的检测，同时较为准确地反映早期肺腺癌的存在。

此外，该技术还可用于诊断其他类型的肿瘤，如结直肠癌和卵巢癌等。

与传统的组织检查方法相比，血浆游离DNA检测技术实现了肺癌早期检测的无创化和更为方便的样品采集。

【规范与指南】血液样本微生物游离DNA的NGS检测原理与应用京港感染论坛早诊快诊，助力精准防治01已知可引起人类疾病的微生物多于1000种，病原学的探寻始终是感染性疾病诊治的重要环节，对于一些类型的感染性疾病，病因的探求仍然存在很大的困难，尤其对于血流感染，超过50%尚不能明确病因。

随着病原NGS的广泛应用和不断成熟，已成为感染检测的重要手段。

本文将以血液样本的病原微生物NGS检测为主要内容，对其检测流程、特征、临床应用、阈值、性能验证与质控进行介绍与分享。

0203病原mNGS检测的原理如下图左侧所示，相对于非感染人群，患者的临床标本中如果某种微生物核酸大量检出，而非感染人群中该微生物核酸量未检出或明显低于感染患者，则意味着该微生物是感染病原体的可能性较高。

病原mNGS检测流程包括标本采集、运输、核酸提取和富集、建库测序、生信分析以及可疑病原菌报告。

检测流程受到众多的因素影响。

标本的优化选择、快速的转运、恰当的保存、人源背景的处理、合理提取及建库试剂盒的选择、测序的平台、深度、测序序列长度、数据库分析、合理化报告都会直接影响到报告的质量。

04整个mNGS检测的过程，就好比这样的一个过程：样本就像一个上了锁的书箱，箱子里的书本就是人与微生物的基因组。

由于受限于目前的技术，无法轻松的打开箱子获取其中的完整信息，因此我们采用一系列湿实验的方法，把这个箱子摧毁，这时书本已经被损坏，变成了一张张碎纸条，这些碎纸条就是所谓的DNA片段，经测序后变成了我们说的reads。

碎纸条上由四种字符组成-“ATCG”，基于这些碎掉的片段，我们去图书馆查找出处，这里的图书馆就是大家常说的“基因组数据库”。

例如“假作真时真亦假，无为有处有还无。

”我们可以还原到《红楼梦》。

在报告中的读长数（reads）即是我们拿到纸条的数目，如果我们看到很多的纸条都来自同一本书（比对到同一微生物的序列数较高），覆盖的书本章节越多（基因组的覆盖度越高），则代表其更加可靠。