如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)

《转Cry1Ab基因抗虫水稻的检测方法研究》一、引言随着现代农业科技的进步，转基因作物因其抗虫、抗病等特性，在农业生产中得到了广泛应用。

其中，转Cry1Ab基因抗虫水稻因其显著的抗虫效果，成为了研究的热点。

然而，对于这种转基因水稻的检测方法仍需深入研究，以确保其安全性和有效性。

本文旨在研究转Cry1Ab基因抗虫水稻的检测方法，为农业生产提供科学依据。

二、材料与方法1. 材料本研究所用材料为转Cry1Ab基因抗虫水稻及其对照组非转基因水稻。

2. 方法（1）DNA提取：采用CTAB法提取转基因水稻和对照组水稻的基因组DNA。

（2）PCR扩增：利用特异性引物，对提取的DNA进行PCR 扩增，扩增Cry1Ab基因片段。

（3）电泳检测：将PCR产物进行电泳，观察条带，初步判断Cry1Ab基因是否成功转入水稻中。

（4）荧光定量PCR：利用荧光定量PCR技术，对转基因水稻中Cry1Ab基因的拷贝数进行精确检测。

（5）免疫学检测：采用Western Blot技术，对转基因水稻中Cry1Ab蛋白进行检测。

三、实验结果1. PCR扩增结果电泳结果显示，转基因水稻组在Cry1Ab基因特异位置出现条带，而非转基因水稻组则无此条带，初步判断Cry1Ab基因已成功转入水稻中。

2. 荧光定量PCR结果荧光定量PCR结果显示，转基因水稻中Cry1Ab基因的拷贝数显著高于非转基因水稻，证明了转Cry1Ab基因的成功导入。

3. Western Blot结果Western Blot结果显示，转基因水稻中成功表达了Cry1Ab蛋白，而非转基因水稻组则无此表达。

四、讨论本研究采用多种方法对转Cry1Ab基因抗虫水稻进行检测，包括PCR扩增、电泳检测、荧光定量PCR和Western Blot等。

实验结果表明，这些方法可以有效地检测出转基因水稻中Cry1Ab 基因的成功导入及其表达情况。

其中，PCR扩增和电泳检测为初步判断方法，可快速筛选出转基因水稻；荧光定量PCR和Western Blot则为精确检测方法，可对转基因水稻中Cry1Ab基因的拷贝数和表达情况进行精确测定。

转基因拷贝数鉴定引言转基因技术是指通过人为的方式将外源基因导入到目标生物体中，从而使其获得新的性状或功能。

转基因作物在农业生产中得到广泛应用，但其安全性和可行性一直备受争议。

转基因拷贝数鉴定是一种用于确定转基因作物中外源基因拷贝数目的方法。

本文将详细探讨转基因拷贝数鉴定的原理、方法和应用。

转基因拷贝数的重要性转基因拷贝数指的是转基因作物中外源基因的拷贝数目。

转基因拷贝数的多少直接影响着外源基因的表达水平和转基因作物的性状稳定性。

因此，准确鉴定转基因拷贝数对于转基因作物的研究和应用具有重要意义。

转基因拷贝数与外源基因表达水平的关系转基因拷贝数与外源基因的表达水平呈正相关关系。

拷贝数越多，外源基因的表达水平越高，从而使转基因作物获得更强的性状。

因此，通过鉴定转基因拷贝数，可以预测和调控转基因作物的性状。

转基因拷贝数与转基因作物的性状稳定性的关系转基因拷贝数还与转基因作物的性状稳定性密切相关。

拷贝数越多，外源基因在转基因作物中的遗传稳定性越高，性状表现越稳定。

因此，鉴定转基因拷贝数可以评估转基因作物的性状稳定性，为转基因作物的选育和推广提供重要依据。

转基因拷贝数鉴定的方法转基因拷贝数鉴定是通过比较转基因作物中外源基因与内源基因的拷贝数目来确定的。

目前常用的转基因拷贝数鉴定方法包括定量PCR法、Southern blotting法、荧光原位杂交法等。

定量PCR法定量PCR法是一种常用的转基因拷贝数鉴定方法。

该方法利用PCR技术在转基因作物中同时扩增外源基因和内源基因的DNA片段，通过比较两者的信号强度或荧光强度来确定外源基因的拷贝数。

Southern blotting法Southern blotting法是一种经典的转基因拷贝数鉴定方法。

该方法首先将转基因作物中的DNA进行限制性内切酶切割，然后通过电泳将DNA片段分离，再利用DNA 探针与目标片段进行杂交，最后通过放射性或化学荧光信号来检测外源基因的拷贝数。

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数仇有文;张明辉;高学军;曲波;敖金霞;袁肖寒;刘营;霍楠【摘要】[目的[采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数.[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数.[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x+35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x+34.890,R2=0.999.nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝.[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据.%[ Objective ] It is to adopt Taqman quantitative PCR technique to detect the copies of foreign nos terminator in transgenic hybrid soybean. [ Method ] With endogenous reference gene of soybean lectin, and endogenous reference standard of gene complex DNA in non-GMO soybeans, the method of gradient dilution was used to separately calculate Ct value of endogenous reference gene and plasmid DNA and relevance standard curve equation of logarithm of copies, and then to calculate the copies of samples through substituting thus-obtained Ct into standard curve equation. [ Result ] The standard curve equation of endogenous reference gene isy = - 3.422x + 35. 201 , R2 = 0. 998; and the standard curve equation of foreign gene is y = - 3. 348x + 34. 890, R2 = 0.999. Nos terminator and its lower boundary sequences in transgenic soybean is ofsingle copy. [ Conclusion] The study has provided a theoretical basis for determining foreign gene copies in transgenic soybean.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)017【总页数】3页(P10150-10152)【关键词】Real-time PCR;转基因杂交大豆;拷贝数;Lectin;nos终止子基因边界序列【作者】仇有文;张明辉;高学军;曲波;敖金霞;袁肖寒;刘营;霍楠【作者单位】东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030【正文语种】中文【中图分类】S188+.1实时荧光定量PCR技术是一种新的DNA定量方法[1]。

在毕赤酵母中，外源基因能够在基因组的同一位点进行多次同源重组，从而插入多个拷贝的外源基因。

而高拷贝的外源基因通常会导致其在毕赤酵母中的高表达［1］。

比较外源基因在毕赤酵母中表达量的差异时，如比较不同启动子的转录活性时，往往需要检测外源基因的拷贝数，筛选单拷贝整合外源基因的毕赤酵母菌株。

目前，在毕赤酵母的研究中，Southern blot 是运用最多的检测外源基因拷贝数的方法［2］。

但该方法需要大量的DNA ，工作量大，操作要求高。

近年来，荧光定量PCR 技术不断成熟，并已开始用于检测外源基因的拷贝数，如在转基因植物研究领域，已利用该项技术检测外源基因的拷贝数［3］。

但相关文献报道较少。

本文以毕赤酵母中的看家基因GAP （Glycer －aldehyde -3-phosphate dehydrogenase ）为内参，绿色荧光蛋白（GFP ）基因为报告基因，采用双标准曲线实时荧光定量PCR 法，建立了一种测定毕赤酵母中外源基因拷贝数的方法，现报道如下。

1.材料与方法1.1菌株及质粒大肠杆菌Top10、毕赤酵母GS115及质粒pPIC3.5K 均购自Invitrogen 公司；含GFP 基因的毕赤酵母GS115-KDR -P 菌株由本室保存；pMD19-T Simple 载体购自TaKaRa 公司。

1.2主要试剂及仪器Premix Taq （Ex Taq TM Version ）和连接试剂DNA作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（上海200237）.通讯作者：周祥山，E -mail ：xszhou@中国图书分类号Q789文献标识码A文章编号1004-5503（2009）12-1236-05【实验技术】实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数宣姚吉周祥山张元兴【摘要】目的建立实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。

方法采用双标准曲线法，分别利用含有GAP 基因和绿色荧光蛋白（GFP ）基因的质粒，进行实时荧光定量PCR 反应，建立标准曲线。

southern blotting确定拷贝数原理
Southern blotting是一种分子生物学技术，主要用于检测DNA中特定序列的存在以及确定DNA拷贝数。

以下是Southern blotting确定拷贝数的基本原理：
1.DNA片段分离：首先，将待检测的DNA样本通过酶切等方法进行分离，生成一系列DNA片段。

这些片段的长度和序列将取决于所使用的酶。

2.凝胶电泳：将DNA片段加载到琼脂糖凝胶中，并通过电泳使其在凝胶中移动。

由于DNA片段的不同大小，它们在电场中会按照大小被分离开来，形成一个DNA带谱。

3.转移到膜上：将DNA凝胶上的分离片段转移到一块膜上，通常是硝酸纤维素或硝酸纸。

4.固定DNA到膜上：通过紫外线照射或烘烤等方法，将DNA片段固定在膜上。

5.杂交：将标记有放射性或荧光标记的DNA探针加到膜上。

这个探针是与待检测DNA 特定序列相互匹配的DNA片段。

6.探针与目标DNA杂交：探针与膜上DNA片段中与之互补的序列发生杂交。

这样，可以通过检测探针的位置来确定待检测DNA中特定序列的存在。

7.确定拷贝数：通过观察带谱的强度和数量，可以推断出待检测DNA中特定序列的拷贝数。

如果一个序列在DNA中存在多个拷贝，相应的带谱会更强烈。

总体而言，Southern blotting提供了一种分子水平上检测DNA片段的方法，并且可以用来确定目标序列在基因组中的拷贝数。

鉴定转基因是否成功的方法
转基因是一种重要的遗传工程技术，可以将外源基因导入到生物体内，从而改变其性状和功能。

但是，如何鉴定转基因是否成功呢？下面介绍几种方法。

1. PCR扩增法。

PCR是一种可以扩增DNA序列的技术，可以通过PCR扩增转基因序列和内部参考序列，然后对扩增产物进行电泳，观察是否存在目标大小的DNA条带，从而证明是否成功转基因。

2. Southern blotting。

Southern blotting是一种检测DNA序列的方法，可以将DNA片段转移到膜上，然后使用探针特异性检测转基因序列的存在。

3. Northern blotting。

与Southern blotting类似，但是是用来检测RNA序列的方法，可以检测目标RNA是否被表达。

4. Western blotting。

Western blotting是一种检测蛋白质的方法，可以检测目标蛋白质是否被表达。

5. 生理表型。

转基因生物的表型通常会发生明显的变化，如植物的生长速度、耐旱能力、抗病性等。

通过观察生理表型的变化，也可以鉴定转基因是否成功。

综上所述，以上方法可以用来鉴定转基因是否成功，研究人员可以根据需要选择合适的方法。

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荧光定量PCR检测细菌染色体上基因拷贝数2OO6年4月第26卷第4期ChinJMicr~iolInemmol,April2006rV ol26tNo.4.免疫检测.荧光定量PCR检测细菌染色体上基因拷贝数刘广文闫梅英梁未丽高守一阚飙【摘要】目的建立一种以细菌染色体上1个已知拷贝管家基因作为基准,通过荧光定量PCR检测其他被检基因拷贝数的方法.方法利用荧光定量PCR检测El110r型霍乱弧菌染色体上目的基因zot与基准基因thyA的Ct(thresholdcycle)值差值,根据已知拷贝数菌株N16961的两基因Ct值之差来推算待测菌株中zot基因的拷贝数.结果利用thyA基因作参照,确定11株E1Tot 型霍乱弧菌中zot基因的拷贝数在1～5个之间,对较少拷贝数的检测与Southemblot确认的相同,对多拷贝数检测优于,Southernblot的判定.结论本方法可以准确检测菌株染色体上的基因拷贝数. 【关键词】荧光定量PCR;基因拷贝数;霍乱弧菌1hecopymtmher0fthegtmeinchrmnmmne0fstraindetectedbytherealtimeqIl衄titativeP 【删C.tt/t/ng-~,ⅣM~y/ng,4^『G,G40Shou-y/,uvB/ao.Nat/ona//nst/tuteforCommm/mb/eD/s —easeControland尸,删咖,l,StatejLaboratoryforlnfect/ous西尸,删肌砌,landContro/,aC~forD/smseContro/and~/lt/on,&,,206,C轴mG陀删姗皿撕:B/ao,Ema//:kanb/ao@/【AI,sI瑚d】ObjectiveToestabhsharealtimequantitativePcRmethodfordetectinggenecopyllun~rs inchromosomeDNAofbacteria.MethodsCtvaluesofgeneszotandthyAofmrcho/erae81rai nsaredetect—ed.andthedifferenceofCtvaluesbetweenthesetwogenesiSidentified.rI11ecopynumberof genezotofonestraini8determinedwiththereferenceofCtvaluedifferenceofstrainNl6961.ResultsCopyn unlbersofzotgeneamongllofdetectedm砌cho/eraeElrI10rstrainsweredeterminedfromlto5withthyAasthereference.It showedthattheestablishedmethodiSasgoodasSouthernblotintermsofdetectinglowcopyn umbersofgenes,andi8betterfordete~highcopyIlllnlbers.Cllmdll~Ollt111equantitativePCRcallbeap~edt oaccurately detectcopynumbersofgenesinchromosomeDNAofbacteriastrains.【Keywords】RT_P(;Genecopynumber;Wb砌chderae多拷贝基因在细菌中广泛存在,而且多是些可移动的遗传成分,它们在细菌的遗传,进化及致病过程中具有重要作用,构建这类重复基因成分的物理图谱是研究其结构和功能的一个重要方面.在分析中往往需要测定这些重复片段的基因拷贝数,但是,当基因为规则的串连拷贝重复,尤其超过两个以上时,利用Southernblot等技术分析物理图谱难以确定具体的拷贝数.荧光定量PCR是一种准确可靠的可以定量检测基因拷贝的方法,具有快速灵敏和高通量的特点,而且该方法无需对扩增样品进行任何后续处理过程,避免了PCR产物的污染问题【1J.目前较为广泛地应用于对基因表达量的测定,即mRNA的定量检测,以及对一些肿瘤相关基因,病原体,转基因等进基金项目:国家十五科技攻关计划课题资助(2003BA712A05.04);国家重大基础研究项目(973)课题(G1999054m2)作者单位:102206北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室通讯作者:闻飙,FJmstil.,***************,电话:OlO1嗍58行检测.荧光定量PCR分析时的一个主要参数就是Ct(thresholdcycle)值,即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.研究表明,当固定荧光信号值后,每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系乜】.本研究中,我们用细胞内染色体上的一个管家基因作基准,检测同细胞染色体上的另一个基因拷贝数.与传统的利用内标做标准曲线来绝对定量不同,我们是通过荧光定量PCR建立了一种检测细菌中基因拷贝数的方法:选取细菌基因组中结构一致,拷贝数已知并且恒定的管家基因作为基准,利用荧光定量PCR检测同细胞内目的基因的拷贝数.该方法是根据参照的管家基因和待测基因的扩增Q值来确定后者的拷贝数,无需绘制标准曲线绝对定量,只根据相对的Q值差便可得出目的基因的拷贝数.同时由于管家基因与待测基因在同一个细菌细胞的染色体上,因此对待测基因拷贝数的分析是在一个独立的反应体系内进行的,即针对一次用于检测的DNA样品进行检测.免疫学杂志2OO6年4月第26卷第4期ChinJMicmbiolInmmnol,April2006,V ol26,No.4霍乱弧菌染色体中有携带霍乱毒素基因的溶原性噬菌体基因组,并且该基因组可在染色体上出现多拷贝的串联重复b].我们以霍乱弧菌中单拷贝管家基因thyA为内标基因【4检测了ElT0r型霍乱菌株中CTX~P基因簇的拷贝数.我们以C①基因簇核心区的zot基因作为检测的目的基因【5],利用这种荧光定量PCR方法对菌株内基因簇的拷贝数进行了测定,并且用杂交补充验证.材料和方法菌株:见表1.我们还包括了一些没有C基因组的E1Tor型菌株,如40-42,93097,Ku40等作为检测zot基因的阴性对照.仪器及试剂:荧光定量PCR仪为RocheLightCy—cler;荧光探针及引物由上海基康公司标记合成;限制性核酸内切酶,ExTaqDNA聚合酶及Pc体系由TaI(aRa宝生物工程有限公司提供;核酸纯化用QIA—GEN试剂盒;地高辛(DIG)标记与检测试剂盒购自德国Roche公司.表1实验中所用的霍乱弧菌日Tot型菌株1曲k1.Irtbr/odlDl阴ElTorstab荧光定量VCS._thyA基因上游引物序列为:5一ACATGGGACGCGTGTATGG-3,19bp,下游引物序列为:5'-ATATGACCACCA TCAGGC~AGC一3,23bp.荧光探针用FAM标记,序列为:5FAM—TIEAGC~一TAGAGC33W,-3,61bp;zot基因的上游引物序列为:5'-C,~CAGATGCGACCACA T-3,18bp,下游序列为:5'-GCAC3W,GGCGAGAAAGGA一3,18bp.FAM标记的荧光探针序列为:5FAM—ATCGA TAAAGAGAAACGC一3,57bp.两对引物的理论Tm值为58℃～59℃.扩增体系:25体系中含dNTP0.3mmol/L,Md5mmol/L,引物各0.2tanol/L,荧光探针0.24tanol/L, ExTaq酶0.05.扩增参数:92℃预变性5min;92℃30S,60℃30S,4o个循环.加样方法:在每次扩增时,将共有的反应组分配好后加入模板(加入量为预实验中获得的在检测线性范围内的模板量),充分混匀后,等量分为检测thyA基因与zot基因的两个反应体系,加入各自的引物和探针,混匀后再分装做平行检测.这样既保证了模板一致,同时也可检测荧光定量PCR的稳定性.每株菌进行6～9次重复检测.ACt值的校正:检测各菌株thyA基因与zot基因的ct值,以thyA基因的ct值减去zot基因的ct值得到两基因Ct值的差值,记为ACt.每个菌株每次平行检测2个基因均获得一个原始ACt,然后将该菌株每个重复实验的所有ACt的均数作为该菌株的平均ACt.菌株N16961全基因组序列已测定,其2个基因拷贝数均为1,该菌株的ACt值可认为是由于两基因扩增效率和引物序列等系统误差造成的, 将其作为ACt的本底,即将N16961菌株的ACt值调整为0,其他菌株也做相应校正:把被检菌株的平均ACt值减去N16961的平均ACt值,得到的便是被检菌株的校正ACt值(adjustedACt,缩写为adACt).zot基因拷贝数的换算:由于霍乱标准株N16961中zot基因为单拷贝,而thyA基因在霍乱弧菌中高度同源且为管家基因,因此不同菌株的adACt值可以代表单拷贝的zot基因达到该菌株内zot基因相应拷贝数(CN)时所需的PCR扩增循环数,根据PCR的倍数扩增原理,CN=1X2拙,可以计算出zot基因在菌株中的拷贝数,最后用取整函数ROUND得出具体拷贝数.zot基因杂交探针的制备:以N16961为模板进行PCR,所用的上游引物序列为:5'-AAACCTI'. GAACGCATAGC-3,下游序列为:5'-GCCCA TAGAC—CACGATAA-3,产物长度为846bp.将扩增产物回收纯化,然后依照试剂盒进行DIG随机引物法标记. 酶切及杂交检测:打点杂交时,集1.5ml菌液溶于50的三蒸水中,然后水煮10rain,冰浴10 min,再离心取上清作为杂交模板,取5模板点于硝酸纤维素膜上,烤干后进行杂交显色;Southemblot 时,染色体经PstI酶切后按照操作进行杂交显色㈦.统计学方法:数据用SPSS11.5软件进行处理分析.P<0.05为差异有统计学意义.结果l-荧光定量l_【检iN!耐基因的特异性:并非ChinJMicr~idInmamol,Aofil2OO6,vd!N01璺所有ElT0r型霍乱菌株均含有㈣基因组,在我们分析的l4株菌株中,利用标记的zot基因探针通过染色体DNA的打点杂交检测这些菌株,同时将这些菌株利用设计的扩增zot的荧光PCR体系进行检测,发现在zot基因探针杂交阴性的3株菌中,荧光定量PCR检测zot基因的Ct值大于36,zot基因探针杂交阳性的11株菌株荧光定量PCR检测zot基因的Ct值小于24,因此两者检测结果完全一致.2.荧光定量PCR检测菌株thyA基因和zot基因的Ct值结果:数据处理只针对11株zot阳性菌株.将每株各次的ACt值取均数作为该菌的平均ACt,结果其标准差均小于0.2,同时所有菌株的thyA基因及阳性zot基因的Ct值均小于25,表明本实验数据可靠】.图1显示了部分菌株的单次实时PCR荧光曲线图.lO09080706050403020l0l0o9080706050403020l0l0090善;60耋:3.0l00510l52025303540Cyclenumber图13株酉株的实时PCR荧光曲线图啦!.mlawtsaalceOllrV~efreallimePCRefthreestrains3.根据校正的ACt值对菌株进行zot基因拷贝数分析:对11株阳性E1Tor型霍乱弧菌的ACt数据分析见表2,zot基因的拷贝数结果见图2.4.不同zot基因拷贝数菌株之间差异的统计学检验:根据以上结果,我们按zot基因拷贝数对数据重新分组,然后进行组间adACt值的统计学检验.结果为不同拷贝数的菌株之间差异都具有统计学意义,均P<0.05,表明本实验中得到的菌株zot基因拷贝数结果具有统计学意义.5.Southernblot分析菌株的zot基因拷贝数:霍乱弧菌染色体经PstI酶切(PstI在c1x基因组内有1个酶切位点,但不在zot基因内)后与DIG标表2ElTor型霍乱弧菌蜘与删f基因的ACt值数据分析Table2.Anal~sefda恤ACtef姆Ageneandzo~gene.mV.cJIanElTo~strains12345678910l1EcholeraeE1T0rSHRill图2检测的ElTot型霍乱弧菌的zot基因拷贝数结果啦2.Copynmnber0fzotgmeind~efmltV.c=IIstrains1:N16961;2:DllS;3:Wujians2;4:2001-6;5:23-62;6:2477; 7:63-12;8:86015;9:93284;10:97-84;11:98185记的zot探针杂交,结果见图3.表明通过荧光定量PCR方法计算出的zot基因拷贝数,当为1～2个拷贝时,Southernblot也可以检出;而基因拷贝数多于3的菌株2001-6,Southemblot仅显示了2条杂交条带,是因为㈣在染色体上的多拷贝串联重复,少于用荧光定量PCR方法检测计算的拷贝数.如果当基因组呈规则的序列一致的串连拷贝重复且大于2个时,利用内部切点消化进行Southemblot,则会产生相对分子质量大小相同的片段相互重叠,难以用Southemblot确定拷贝数.因此该方法比杂交的检出范围广.荧光PCR未检测到zot基因的40-42菌株杂交结果为阴性.讨论本文将荧光定量PCR应用于对核酸DNA基因654321O写暑aq茸暑二0U(×103)23.O9.46.64.4生2OO6年4月第26卷第4期ChinJMicrobiolImmunol,April2006,V ol26,No.4 圈3霍乱弧菌的z.ot探针Soulhernblot结果Fig3.Southernblothybr~bafionofV'~r/ocho/eraestrai~withfprobe1:NHindⅢ;2:N16961/PstI;3:2001-6/PstI;4:23—62,PstI;5:93284/PstI;6:Dll8/PstI;7:40-42拷贝数的检测中,与传统的利用内标和标准曲线对基因进行绝对定量不同】,我们是通过选定一个在同类菌株中结构保守,含量恒定的基准基因,并且与被检基因位于一个细胞的染色体上来检测目的基因在基因组中的拷贝数含量.我们选择在同一染色体上的已知拷贝数的管家基因作基准,其优势是被检基因与基准基因由于共同存在于同一染色体或同一个细胞内,因此无需考虑加入反应体系的DNA模板的绝对量,尤其是不同批次实验之间的差异,便可使两基因在PCR反应中的初始模板含量相同,每个反应都是独立并直接获得拷贝数结果的,不必考虑不同批次的实验的可比性.该方法适用的前提是基准基因与被检基因扩增效率应可比.基准基因稳定存在于同类菌株的染色体上,而且拷贝数相同,它与目的基因的引物扩增条件和扩增效率在理论上应差别不大;同时在体系中模板量要有较合适的浓度,以保证在荧光定量PCR检测的线性范围之内.通过检测菌株中两基因的ct值,根据PCR扩增原理计算目的基因的拷贝数,可以为绘制基因的物理图谱提供依据.在霍乱弧菌中,溶原性丝状噬菌体CIX~p可携带霍乱毒素的编码基因】,整合于染色体上的CIX~p基因簇可被诱导为噬菌体颗粒【5】.利用荧光定量PCR分析CIX~p在不同菌株的拷贝数,同一细胞内zot与thyA基因拷贝数之比与ACt呈二倍指数关系,由于标准株N16961的两基因拷贝数均为1,将其ACt作为系统误差对其他菌株的ACt进行校正,便可用于推算其他菌株目的基因zot的拷贝数,也就是基因簇的拷贝数.此结果能为下一步霍乱弧菌中㈣基因簇物理图谱的绘制提供依据,补充Southernblot不能确定重复串联拷贝的不足.在低拷贝数时Southemblot结果与该方法测出的拷贝数相符.对于某些含多拷贝的菌株,Southemblot不能准确判断拷贝数,原因可能是由于目的基因串联排列导致酶切片段的重叠,其直观结果便是杂交条带少于荧光定量PCR检测的拷贝数目.本设计思路在应用过程中,需要有合适的基准基因,如选用管家基因或菌种内的高度保守的并且拷贝数已知的基因.通过可以检测低拷贝基因的荧光定量PCR【1,我们建立的这种相对比较ACt的方法,消除了不同基因扩增效率之间的系统差异,利用基准基因含量恒定的性质得出菌株的目的基因拷贝数与ACt之间的关系.荧光定量P(不能取代其他的Southernblot等分析n】,但由于具有高通量,高灵敏性及数据处理简便,可靠等优点,本方法更适用于对大量菌株进行的多拷贝基因的精确检测及筛选,可便捷地为基因组物理图谱的构建提供有价值的信息.参考文献1HeidCA.StevensJ."vakKJ,eta1.R朋lmqu~tafivePCR.Ge- rmRes.1996,6:98&994.2I-Egu~R.Foc~erC,DcG.eta1.KiIlcPCRanal~s:-time~omtofing0fDNAamplificationre0m.Biotechnol,1993,11 (9):1026-1030.3NandiS,MaitiD,SanaA,eta1.G呵lesis0fvariants0fVibr/odugeme O1biotypeE1Il僭:role0ftheCTXOarrayanditsp08id∞inthege- nollle.Microbiol.2003.149:89-97.4MoronaR,Y eadmJ,ConsidineA,eta1.Constmction0fplasmidvec-totswithanon-antibioticselectionsystembased∞theEsdeddliacoli thyA铲ne:applicationtocholeravaccinedevdopment.‰,1991,107(1):139.144.5WaldorMK,RubinEJ,PearsonGDN,eta1.Rs~jlafiqn,replication, andintegrationfu/lctioll$0ftheV'dv/ocho/eraecrxoal℃encodedbyre- gi∞RS2.MolMicrobial,1997,24:917-926.6黄培堂等译.分子克隆实验指南.第三版.北京:科学出版社, 2002.7lRbrlerB,e0freal-timePCRfordetemlir.iIlgcopynuln- betandzygosityin曲n昭∞icplants.PlantCellR印,2004,23(5): 263.271.8GibsonUE,HeidCA,WflliaHbPM.Anovelmethodforrealtimequan. titativeRT-PCR.Genc~neRes,1996,6(10):995.10o1.9WaldorMK,M~alanos叮.Lrsosenicconversionbyamm0IIsplIdge 豇lc0dingcholeratoxin.Scieace,1996,272:1910-1914.10TeoIA,ChoiJW,MorleseJ,eta1.LightcyderOptilniT~OHfor lowcopynumbertalgetDNA.Jhnnmm~lMethods,2002;27O(1):119? 133.(收穑日期:2005-06-16)。

利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究王育花;赵森;陈芬;肖国樱【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2007(11)4【摘要】转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素,因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键.利用高通量、快速、灵敏的SYBR Green Ⅰ荧光定量实时PCR法,检测了转大麦烟酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷贝数.以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为水稻的内源参照基因,通过梯度稀释法,分别获得了NAS1和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线,相关系数分别为0.999 76和0.995 71,相关性高.通过目的基因NAS1和水稻内源参照基因SPS起始模板数的比较,获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数,在8株转基因株系中,1株为假阳性,1株拷贝数为1,3株拷贝数为2,其余3株拷贝数分别为3、4和7,而阴性对照拷贝数为0.这种方法快速、简便、准确,可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择.【总页数】5页(P301-305)【作者】王育花;赵森;陈芬;肖国樱【作者单位】中国科学院,亚热带农业生态研究所,中国湖南,长沙,410125;中国科学院,研究生院,中国北京,100049;中国科学院,亚热带农业生态研究所,中国湖南,长沙,410125;中国科学院,研究生院,中国北京,100049;中国科学院,亚热带农业生态研究所,中国湖南,长沙,410125;中国科学院,研究生院,中国北京,100049;中国科学院,亚热带农业生态研究所,中国湖南,长沙,410125【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.荧光定量PCR法检测重组毕赤酵母工程菌的外源基因拷贝数 [J], 郭晋霞;何云凤;范开2.荧光定量PCR法检测重组毕赤酵母工程菌的外源基因拷贝数 [J], 郭晋霞;何云凤;范开;3.利用实时荧光定量比较Ct法检测转基因小鼠外源基因拷贝数 [J], 林维石;刘纯杰;王芃;程萱;袁盛凌;陈红星;林艳丽;陶好霞;王艳春;王令春4.利用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数体系的建立 [J], 李斌;奥斯曼;张冬杰;巴桑珠扎;赵丽;刘娣5.利用实时荧光定量PCR方法分析转基因水稻外源基因拷贝数 [J], 杨立桃;赵志辉;丁嘉羽;张承妹;贾军伟;张大兵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。

该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。

荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。

在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。

荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。

实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。

数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。

通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。

数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。

荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。

通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。

1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。

该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。

荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。

如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。

第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。

一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。

在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。

插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。

因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。

1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。

其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。

Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。

另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。

如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。

这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。

2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。

实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。

其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。

数字PCR和荧光定量PCR检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数方法的建立及其应用谢秀菊;夏启玉;刘帅;麦贤俊;贾瑞宗;郭安平;徐志胜;李峰;孔祥义;赵辉【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2024(45)4【摘要】传统的检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法是Southern杂交,该方法成本高、周期长,难以满足高通量检测外源基因拷贝数的育种需求,因此,本研究旨在建立快速且高通量检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。

本研究从番木瓜基因组中筛选出2个单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770,以已知外源基因为单拷贝整合的转基因番木瓜为参照,利用数字PCR鉴定其拷贝数,进一步以其为内参基因,以番木瓜转基因育种常用的筛选标记基因NPTⅡ为外源目的基因,建立利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。

结果表明:Cpa03g018830和Cpa03g018770均为单拷贝基因;建立的数字PCR 方法对转基因番木瓜中的外源基因拷贝数的检测准确可靠,而荧光定量PCR对转基因番木瓜中外源基因单低拷贝整合的检测准确度较高,对外源基因多拷贝整合的检测准确度则较低,因此,荧光定量PCR适合用来在大量转基因植株中初筛出单低拷贝整合的植株。

本研究鉴定的单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770可作为转基因番木瓜中外源基因拷贝数检测的内参基因,且建立的利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法,操作简单,速度快,适合批量检测,可为番木瓜转基因抗病育种中单低拷贝株系的选育提供新的方法。

【总页数】11页(P663-673)【作者】谢秀菊;夏启玉;刘帅;麦贤俊;贾瑞宗;郭安平;徐志胜;李峰;孔祥义;赵辉【作者单位】中国热带农业科学院三亚研究院/中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室;南京农业大学;三亚市热带农业科学院;山东舜丰生物科技有限公司【正文语种】中文【中图分类】S667.9【相关文献】1.应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法2.利用实时荧光定量PCR 法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究3.利用实时荧光定量PCR方法分析转基因水稻外源基因拷贝数4.TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Southernblot实验⽅法与步骤Southern blot实验⽅法与步骤⽤于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA⽚段。

⽤于基因诊断，也可验证检测⽚段的分⼦量⼤⼩。

将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进⾏琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分⼦量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移⾄⼀固相⽀持滤膜。

利⽤标记的某⼀DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发⽣同源性杂交，利⽤放射⾃显影（化学发光法或显⾊法）检测。

（⼀）器材：台式离⼼机，恒温⽔浴锅，电泳仪，⽔平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸⽔纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶⽚。

（⼆）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20? wSSC （3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针， 2?wSSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1MNaCl,PH7.5），抗－地⾼⾟－碱性磷酸酶。

注意：若基因组DNA过低，要以较⼤体积进⾏限制酶消化，消化完毕后，可以通过⼄醇沉淀、浓缩DNA⽚段，加少量DNA加样缓冲液点样。

2、消化好的样品点样于0.7％琼脂糖凝胶进⾏电泳；注意：为保证DNA均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加⾄加样孔。

DNA提取、转基因植株PCR阳性检测及转基因拷贝数检测本资料由ourshoper搜集1 DNA提取对于用于转基因植株PCR阳性检测的总DNA，采用小样快速制备法。

取大约2-3 cm 长的叶片在700 µl DNA提取液（50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA, 300 mM NaCl, 1% SDS）中匀浆，56℃水浴30分钟，加等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀离心，上清液用预冷的95%乙醇沉淀，75%乙醇洗涤并用含有RNaseA的TE水溶解。

对于转基因植株拷贝数检测或基因组长片段扩增模板的总DNA的抽提，采用CTAB 法(Zhang et al. 1992)，并稍加以改进（详见附录B，Protocol 4）。

取0.1 g左右的叶片（-20℃冻存），在-20℃预冷的碾钵中用液氮磨成粉状，迅速转入-20℃预冷的的离心管中，加入700 µl 1.5%的CTAB，上下迅速混匀，放入56℃水浴中保温30分钟，5分钟上下颠倒一次，并加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）慢慢混匀20-30[3] [4]分钟，10000 r/min室温离心10分钟，取上清液再加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）和1/10体积的10% CTAB混匀，轻摇20分钟，10000 r/min室温再离心10分钟，再取上清液加入等体积的1% CTAB并摇匀，5000 r/min室温离心5分钟，倒去上清，收集沉淀DNA并吹干，然后用0.5 ml的1M NaCl溶液和1 µl 的RNA酶（1 mg/L）在55℃水浴溶解DNA，DNA经预冷的95 %乙醇沉淀、75%乙醇清洗，微干后溶解在TE溶液（10 mM Tris, 1 mM EDTA）中备用。

2 PCR阳性检测对于以Hpt（hygromycin phosphotransferase）基因为筛选标记的T0代转基因植株，通过引物对Hpt-F（5’-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3’）、Hpt-R上一页 [3] [4]（5’-GTCCTGCGGGT AAATAGCTG-3’）进行PCR阳性检测；对于以Bar基因为筛选标记的转基因植株，通过引物对Bar-F （5’-AACCCACGTCATGCCAGTT-3’）、Bar-R（5’-TCGTCAACCACTAC ATCGAGA-3’）进行PCR阳性检测。

DNA拷贝数的计算方法1.比色法：比色法是一种通过比较待测样本和已知浓度标准样品的光吸收值来计算DNA拷贝数的方法。

该方法需要使用光谱分析仪器进行测量。

具体步骤如下：a)制备已知浓度的标准样品。

按照一定比例稀释得到一系列DNA浓度不同的标准样品。

b)获取已知浓度标准样品的光吸收值。

使用光谱分析仪器在特定波长下测量标准样品的光吸收值，并绘制标准曲线，将浓度与吸光度建立线性关系。

c)测量待测样本的光吸收值。

使用光谱分析仪器在同一波长下测量待测样本的光吸收值。

d)通过比较待测样本的光吸收值与标准曲线，确定待测样本的DNA浓度，并进一步计算DNA拷贝数。

2.荧光定量PCR法：荧光定量PCR法是一种定量测量PCR扩增产物数量的方法，通过测量荧光信号强度来计算DNA拷贝数。

具体步骤如下：a)设计引物和探针。

引物和探针是用来特异性扩增目标DNA序列的短片段，其中探针上标记有荧光染料。

b)进行荧光定量PCR。

将待测样本与引物和探针一起进行PCR扩增反应，并在PCR仪中实时监测每一循环的荧光信号。

c)绘制荧光强度曲线。

根据PCR循环数与荧光信号强度的关系，绘制荧光强度曲线，确定荧光信号与DNA拷贝数之间的线性关系。

d)通过比较待测样本的荧光信号强度和荧光强度曲线，计算出待测样本的DNA拷贝数。

3.基因组测序法：基因组测序法是一种通过测序分析DNA样本中的各个碱基来计算DNA拷贝数的方法。

该方法需要进行高通量测序，并进行后续的数据处理与分析。

具体步骤如下：a)提取DNA样本。

从待测样本中提取DNA，并经过处理和纯化。

b)进行高通量测序。

使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，得到大量的测序数据。

c)数据处理与分析。

利用生物信息学方法对测序数据进行处理和分析，包括去除杂质、比对到参考基因组、计算测序深度等。

d)计算DNA拷贝数。

根据每个碱基的测序深度，结合样本的DNA浓度计算出DNA拷贝数。

综上所述，比色法、荧光定量PCR法和基因组测序法是常用的计算DNA拷贝数的方法。