生物技术通讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY1999年 第10卷 第1期 Vol 10 No.1 1999质粒拷贝数的测定方法周 涛摘要 在研究生物工程重组蛋白产量的过程中，质粒的拷贝数是一个需要重点考虑的参数，对它进行精确定量至关重要。
本文概述了几种主要的测定方法的原理和特点。
关键词 质粒拷贝数；测定方法Determination methods of plasmid copy numberZhou Tao(Institute of Biotechnology, Beijing,100071)Abstract Plasmid copy number, the number of expression vectors in each cell, is a key parameter in the study of productivity of recombinantmicroorganisms. Recognition of the importance of this parameter has givenrise to a number of methods for its determination. this article focuses on the principles and charactistics of these methods.Key words plasmid copy number; determination method细菌质粒是双链、闭环的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在一般情况下对宿主细胞的生存不是必需的，但质粒含有某些基因，可以补充细菌基因的不足，有利于细菌的生存。
质粒DNA的复制要由复制细菌染色体的多种酶共同完成，在宿主中复制的程度差异很大。
质粒拷贝数指的是每个细胞中所含的质粒的个数。
低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1～2次，而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10～200拷贝。
质粒的拷贝数依赖于各种胞内外因素：质粒拷贝数首先决定于自身的遗传性，控制质粒拷贝数的基因位于一个包括DNA复制起点在内的质粒DNA的区域内。
其次，质粒的拷贝数也受细胞生长条件的影响。
细胞的生长速率增大时，质粒的拷贝数下降，主要是因为在高比的生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不断下降［1］。
此外，培养时的温度和培基的组成都对质粒拷贝数有影响，比如当营养物限制或缺乏时会使质粒的拷贝数下降［2］。
为了降低高拷贝数质粒的代谢负担，Remaut等构建了一种所谓潜复制的质粒，在正常情况下每个细胞只有1个拷贝，经诱导后其浓度可达到每个细胞1000拷贝［3］。
一般来说，外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高，但是当拷贝数很大时，拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在了［4］。
这主要有两方面的原因：一方面，高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定，可能是由转录和翻译水平决定的；另一方面，高拷贝数的质粒往往很不稳定。
由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关，因此对于重组蛋白的生产来说，质粒的拷贝数是一个非常重要的参数。
那么迫切需要解决的问题就是如何准确地测定胞内质粒的拷贝数。
现在已经发展了一些测定的方法，大致可以归纳为两类：一类是直接进行测定的方法，包括一些物理分离的方法和杂交的方法；另一类就是间接测定的方法。
下面对这些方法做一个简单的介绍。
1 物理分离的方法物理分离的方法就是将质粒DNA与染色体DNA进行分离并定量。
将质粒DNA与染色体DNA分开主要是基于质粒DNA的两大特性：①质粒DNA 是以共价闭合环状的形式存在，与染色体DNA的线状形式不同；②质粒DNA的分子量比染色体DNA要小得多。
这些方法主要包括：氯化铯-溴化乙锭平衡梯度离心法、凝胶电泳法、高效液相色谱法以及毛细管电泳法等。
1.1 氯化铯-溴化乙锭（CsCl-EB）平衡梯度离心法CsCl-EB平衡离心法是早期经常采用的方法，这种方法分离质粒和染色体DNA，是因为EB与线状和闭合环状DNA分子的结合量有所不同。
EB通过嵌入碱基之间与DNA结合，进而使双螺旋解旋，由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。
最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了EB分子的继续嵌入。
但线状分子则不受限制，可继续结合更多的染料，直至达到饱和，即每两个碱基对大约结合一个EB分子。
正是由于染料结合量的差别，使得线状和闭环DNA分子在含有饱和量EB的CsCl梯度中的浮力密度有所不同，从而达到分离的目的。
如果在细菌的培基中预先加入放射性标记的物质，那么根据回收的DNA条带的放射性强度可以进行定量分析。
1965年，Dewitt在CsCl梯度离心后采用了分部收集的方法，将离心后的产物按密度梯度由高到低分成若干个部分，每部分取出一定的量进行液闪测定。
如图1所示，浮力密度由右到左逐渐增大，前面的“卫星”峰即为质粒DNA峰。
而且分部越细，测定结果的精确度越高。
Clewell及其同事利用这种方法进行了大量的试验，发现放射性物质的回收率有很大的差别，从68%到90%不等［5,6,7］。
根据质粒DNA峰的面积与染色体DNA峰面积的比值即可计算质粒的拷贝数。
图1 CsCl-EB平衡梯度离心法分离菌株S.faecalisDS-5 DNA粗提液［5］CsCl-EB梯度离心法一般需要在超速条件下离心较长时间，比如用垂直转头UTi65需要以45 000 r/min离心16 h，用角转头则时间更长，Ti50以45 000 r/min离心48h，Ti65以60 000 r/min离心24 h，Ti70.1以60 000 r/min离心24 h等等，因为只有这样才能获得较满意的密度梯度。
用CsCl-EB梯度离心法来测定最大的缺点就是分部困难，回收率不稳定，并且十分费时，因此一般都不用来定量，而只做纯化回收质粒之用。
1.2 凝胶电泳（Gel electrophoresis, GE）琼脂糖和聚丙烯酰胺是常用的两种凝胶基质。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5～500 bp）效果最好，分辨力极高，相差1 bp的DNA片段就能分开。
琼脂糖凝胶的分辨能力比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广，从200 bp到50 kb，同时琼脂糖凝胶的制备与操作都比聚丙烯酰胺凝胶容易，因此，分离DNA通常都采用琼脂糖凝胶电泳。
由于在中性pH的电泳缓冲体系中，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动，迁移率的大小与DNA分子大小及立体构象有关。
并且在相同电泳条件下，按照Modsnad模型，小分子是以直线泳动的， 而大分子则以曲线泳动，因而小分子泳动速度较大分子迅速，这样，质粒DNA与染色体DNA就得到了分离。
Wesblum［8］等首先利用了凝胶电泳的这一特性来测定质粒的拷贝数。
他们将培养物进行放射性标记，凝胶电泳后测定各条带的放射性强度。
Projan［9］等人采用荧光标记DNA，通过测定标记物的荧光强度代替测定放射性强度，从而扩大了这一方法的应用范围。
测定荧光强度来确定质粒的拷贝数的方法主要有3个步骤：①琼脂糖凝胶电泳分离细胞裂解液；②溴化乙锭染色；③色谱扫描仪扫描电泳条带。
可以直接扫描凝胶，也可以扫描凝胶照相后的底片，但无疑前者的准确度要高一些，因为扫描底片时除了要考虑荧光信号以外还有胶片敏感性的影响。
如图2，是一典型的凝胶扫描图谱。
利用扫描后的质粒峰与染色体DNA峰的面积比即可计算质粒的拷贝数。
图2 双波长色谱扫描仪扫描凝胶条带的图谱［9］在这一方法中影响测定结果的因素主要有：①加样孔中样品的残留；②染色体DNA对质粒DNA的粘附。
由于染色体DNA比质粒DNA大得多，且非常粘稠，因此它能阻止质粒迁移到特异的位置；③染色与脱色的过程。
其中染色过程的影响不大，因为只要染色时间足够长，染料与DNA的结合就可以达到饱和状态。
脱色过程对双螺旋DNA的影响比对线性DNA的影响要大。
脱色30min后，由于洗去了本底的干扰，荧光的吸收值达到最高，到120min一直维持平台期，之后双螺旋的吸收值明显降低而线性的变化不大；④DNA构象的不同，等量的双螺旋DNA与线性DNA的面积是不相同的，后者大约为前者的1.36倍。
由于以上因素的存在，该方法测定的误差范围是±20%。
Guerrini等认为采用脉冲电场凝胶电泳，可以减少染色体DNA和质粒DNA在琼脂糖基质中的残留，以提高测定结果的准确度。
另外，为减少DNA提取过程中的损失，可用低熔点琼脂糖栓塞法，将细胞去壁后在原位裂解，然后直接进行电泳［10］。
1.3 高效液相色谱（high-pressure liquid chromatography, HPLC）高效液相色谱分析是60年代末70年代初发展起来的一项快速分离分析技术。
用这种方法测定质粒的拷贝数，是通过羟基磷灰石（hydroxylapatite, HPHT）的柱子来实现的。
羟基磷灰石对核酸有较强的吸附力，而对蛋白质、多糖等的吸附力较小，并且核酸的构象不同，吸附力也不同，相对来说，超螺旋的DNA比线性、开环的DNA以及RNA的吸附力都要强。
因此可以用羟基磷灰石对核酸进行分级分离并定量。
HPLC-HPHT法测定质粒的拷贝数只需将全细胞提取物上柱，在一定条件下洗脱，如图3，在两个小箭头之间，是在6 mol/L尿素-0.25 mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)以0.45 ml/min流速的条件下洗脱下来的物质，包括染色体DNA、RNA以及蛋白质。
经0.01 mol/L磷酸钠平衡后，在大箭头处开始梯度洗脱，条件是磷酸钠缓冲液在0.5ml/min流速下，浓度在2分钟内由0.01 mol/L上升为0.4 mol/L。
大约13 min后，质粒被洗脱下来。
因为质粒的浓度与质粒峰的面积成正比，根据已知浓度质粒的标准曲线，就可以确定该质粒的浓度。
应用HPLC-HPHT法进行测定，质粒峰面积的误差为±15%［11］，质粒DNA的回收率为95%左右，并且在纯化的质粒中只残存有少于0.5%的染色体DNA［12］。
一根HPHT 柱大约可以分离200～400个样品。
Genthner［11］用这种方法测定E.coli HB101中的pBR322拷贝数为29，与冷泉港实验室报道的30个相差不大。
图3 采用Bio-Gel HPHT柱分离质粒的洗脱图［11］1.4 毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）毛细管电泳是80年代后期在全世界范围内迅速发展起来的一种分离技术。
毛细管电泳在肽、蛋白质（包括酶和抗体）、核苷酸的分离分析甚至快速序列测定方面都有巨大的潜力，而这种潜力又正好适应了各国在以生物工程、分子生物学等为代表的生命科学各个领域中对各种对象的分离分析和微量制备的迫切要求。
