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提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件：beacon Designer有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。
个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高，适当降低反响退火温度，看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。
看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，〔1〕设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率〔2〕尽量跨越含子，这样可以保证检测有无基因组污染〔3〕两条引物的Tm值不要相差太大〔4〕产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。
.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。
保证在产物Tm80以上〔一般T m=80以下的峰都是引物二聚体〕，对于水稻等GC含量比拟高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。
如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。
〔3〕相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大〔当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在一样位置或者比产物峰还高的错配就死了〕，引物的3'端不要有错配。
〔5〕一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右适宜的位置手动搜索有没有适宜和它配对的评分也比拟高的引物，一般5分钟之可以搞定一个基因。
实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。
最好位于编码区5'端的300-400bp 区域，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。
绪论单元测试1【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术学科建立在分子生物学学科之前。
A.对B.错2【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术是从分子水平研究解决临床诊断与治疗问题。
A.对B.错3【多选题】(20分)现代临床医学的发展方向：（）A.预测医学B.预防医学C.个体化医学D.中西医结合4【多选题】(20分)下列技术为临床分子生物学检验常用检测技术的是（）A.基因测序B.SouthernblotC.分子杂交D.其余均不对5【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术学科发展第一阶段的代表性技术为分子杂交技术。
A.错B.对第一章测试1【单选题】(20分)在人类基因组DNA序列中，DNA甲基化主要发生在（）A.鸟嘌呤的N-7位B.鸟嘌呤的C-5位C.胞嘧啶的C-5位D.胞嘧啶的N-4位E.腺嘌呤的N-6位2【单选题】(20分)下列DNA序列中的胞嘧啶（）易发生甲基化修饰的是。
A.5'-CGCGCG-3'B.5'-GGGGCC-3'C.5'-CCCCCT-3'D.5'-GCACAC-3'E.5'-CTCTCCC-3'3【单选题】(20分)某基因位点正常时表达为精氨酸，突变后为组氨酸，这种突变方式为（）A.移码突变B.动态突变C.无义突变D.同义突变E.错义突变4【单选题】(20分)由于突变使编码密码子形成终止密码，此突变为（）A.无义突变B.移码突变C.终止密码突变D.同义突变E.错义突变5【单选题】(20分)下列叙述哪项是的（）A.原核生物基因组具有操纵子结构B.原核生物结构基因是断裂基因C.原核生物结构基因的转录产物为多顺反子型mRNAD.原核生物基因组中含有插入序列E.原核生物基因组中含有重复顺序第二章测试1【单选题】(20分)DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）A.T－G含量B.A－G含量C.A－C含量D.A－T含量E.G－C含量2【单选题】(20分)Southern杂交通常是指（）A.DNA和RNA杂交B.DNA和蛋白质杂交C.蛋白质和蛋白质杂交D.RNA和RNA杂交E.DNA和DNA杂交3【单选题】(20分)下列哪些不是影响DNA复性的因素（）A.碱基组成B.DNA浓度C.温度D.DNA的分子量E.DNA的来源4【单选题】(20分)探针基因芯片技术的本质就是（）A.基因重组技术B.蛋白质分子杂交技术C.酶切技术D.聚合酶链反应技术E.核酸分子杂交技术5【单选题】(20分)DNA探针的长度通常为（）A.1000～2000个碱基B.400～500个碱基C.<100个碱基D.500～1000个碱基E.100～400个碱基第三章测试1【单选题】(20分)以mRNA为模板合成cDNA的酶是()A.DNA酶B.逆转录酶C.RNA酶D.限制性内切酶E.TaqDNA聚合酶2【单选题】(20分)有关PCR的描述下列不正确的是（）A.引物决定了扩增的特异性B.由变性、退火、延伸组成一个循环C.循环次数越多产物量就越大，可增加循环次数提高产物量D.是一种酶促反应E.扩增的对象是DNA序列3【单选题】(20分)下列关于TaqDNA聚合酶的描述，的是（）A.扩增的DNA片段越长，碱基错配率越低B.催化形成3´,5´-磷酸二酯键C.不具有3´5´外切酶活性D.使DNA链沿5´→3´方向延伸E.以dNTPs为原料4【单选题】(20分)PCR反应过程中，退火温度通常比引物的Tm值（）A.低15℃B.高5℃C.低5℃D.相等E.高15℃5【单选题】(20分)PCR反应中延伸的时间取决于（）A.待扩增片段的长度B.模板的含量C.模板的纯度D.TaqDNA聚合酶的量E.引物长度第四章测试1【单选题】(20分)关于TaqMan探针技术的描述，不正确的是（）A.解决了荧光染料技术非特异的缺点B.R基团与Q基团相距较远，淬灭不彻底，本底较高C.易受到TaqDNA聚合酶5′-3′核酸外切酶活性的影响D.无需进行寡核苷酸熔解曲线分析，减少了实验时间E.操作亦比较简单2【单选题】(20分)以下为比较Ct法的相对定量的描述，不正确的是（）。
SYBR Green I 染料是一种常用于实时荧光定量PCR（qPCR）的荧光探针。
在设计引物时，使用SYBR Green I 染料需要遵循一定的原则，以确保PCR实验的准确性和可靠性。
本文将为你介绍SYBR Green I染料法设计引物的原则。
1. 引物长度在设计引物时，需要考虑引物的长度。
一般来说，引物的长度应该在18到25个碱基对之间。
引物过短可能导致特异性不足，引物过长则可能导致PCR效率下降。
合适的引物长度是确保PCR效果的关键之一。
2. 引物GC含量引物的GC含量是指引物中鸟嘌呤（Guanine）和胞嘧啶（Cytosine）碱基的比例。
在SYBR Green I 染料法中，引物的GC含量通常应在40到60之间。
这是因为引物的GC含量过高或过低都会影响引物与靶序列的亲和性，进而影响PCR的特异性和效率。
3. 引物的配对温度引物的配对温度是指引物与靶序列形成双链DNA的温度。
在设计引物时，需要确保引物之间的配对温度尽量接近。
通常来说，引物的配对温度应在55℃到65℃之间。
引物之间的配对温度差异过大会导致引物之间的竞争，影响PCR的准确性。
4. 引物的特异性引物的特异性是指引物与目标序列的亲和性和选择性。
在SYBR Green I 染料法中，确保引物的特异性是关键。
为了确保引物的特异性，可以通过生物信息学工具对引物序列进行比对，检测引物与非特异靶序列的亲和性。
引物的特异性也可以通过热溶解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳来进行验证。
5. 引物的自身二聚体和互聚体在设计引物时，需要考虑引物的自身二聚体和互聚体的形成。
引物的自身二聚体是指引物与自身形成双链DNA，而引物的互聚体是指两个引物之间形成双链DNA。
引物的自身二聚体和互聚体的形成会影响PCR的特异性和效率。
在设计引物时，需要通过生物信息学工具对引物序列进行分析，以排除引物的自身二聚体和互聚体的形成。
在实时荧光定量PCR实验中，SYBR Green I 染料法可实现对PCR产物的实时定量检测。
08-01 Realtime PCR MasterMix(SYBR Green)Code No. QPK-201, 201T研究用使用说明书TOYOBO CO.,LTD.Biochemical Operations DepartmentOSAKA JANPANDistributor:Shanghai SOLOMON bio-sci&tech,Co.Ltd.Tel:+86-21-33782046 Email:order@“Purchase of this product is accompanied by a limited license to use it in the Polymerase Chain Reaction (PCR) process for The Research Field in conjunction with a thermal cycler whose use in the automated performance of the PCR process is covered by the up-front license fee, either by payment to Applied Biosystems or as purchased, i.e., an authorized thermalcycler.”※LightCyclerTM是Idaho Technology Inc.的注册商标。
※TaqMan®是Roche Molecular Systems Inc.的注册商标。
※ABI PRISM®是Applied Biosystems Inc.的注册商标。
Tel:+86-21-33782046 Email:order@ Http: [1] 前言1．本产品概要本产品已包括除引物和样品DNA以外的所有组成部分，为2×master mix。
qRT-PCR实验步骤应用LightCycler®/LightCycler®480 System Real Time PCR扩增仪的操作方法一、按下列组分配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）注意：1、通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。
反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
2、在20 μl的反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。
因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
另外，2 Step RT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
二、进行Real Time PCR反应LightCycler® 480 System：Stage 1：预变性95℃30s（升温速率4.4℃/s）1 CycleStage 2：PCR反应分析模式：定量分析95℃5s（升温速率4.4℃/s）60℃30s (升温速率2.2℃/秒，Acquisition Mode : Single)40 CyclesStage 3：溶解分析模式：溶解曲线95℃5 秒钟(升温速率4.4℃/秒)60℃1 分钟(升温速率2.2℃/秒)95℃(升温速率0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃)1 cycleStage 4：降温40℃30 秒钟(升温速率2.2℃/秒)1 cycle三、实验结果分析反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
分析方法参见仪器操作手册。
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR，简称RT-QPCR, 属于Q-PCR的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等。
荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman 水解探针的特异性方法。
本视频使用LightCycler® 480 SYBR Green I Master试剂盒介绍SYBR Green I 的非特异性方法。
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料，可与所有的各种序列的双链DNA 分子结合。
在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，嵌入至dsDNA，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，PCR 扩增不同时期中，dsDNA 含量不同，SYBR Green I 荧光信号强度不同。
可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量，并可根据对照进行相关的计算和分析。
实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA。
使用的试剂盒有：用于合成cDNA第一链的罗氏试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，包含了cDNA反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。
配套LightCycler® 480使用的试剂盒LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了PCR所需的各种实验组分，如1号管中包含热启动Taq DNA Polymerase 及反应缓冲液，dNTP mix，SYBR Green I染料和MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。
注意：SYBR Green I Master需避光放置。
10-08SYBR® Green Realtime PCR Master Mix (Code No.QPK-201,QPK-201T)使用说明书科研用TOYOBO CO., LTD. Life Science DepartmentOSAKA JAPAN目录[1] 前言 (1)[2] 本产品的组成 (2)[3] 其他必需品 (3)[4] 使用方法 (4)[5] 常见问题 (8)[6] 相关产品 (10)【 注意 】本产品为科研用试剂。
请勿作为诊断、临床试剂使用。
此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。
本产品是在与F. Hoffmann-La Roche Ltd.、Roche Molecular Systems Inc.及The Perkin-Elmer Corporation的特许合同约定下销售的。
“Purchase of this product is accompanied by a limited license to use it in the Polymerase Chain Reaction (PCR) process for The Research Field in conjunction with a thermal cycler whose use in the automated performance of the PCR process is covered by the up-front license fee, either by payment to Perkin-Elmer or as purchased, i.e., an authorized thermal cycler.”※LightCycler TM是Idaho Technology Inc.和Roche Molecular Systems Inc.的商标。
