下载文档原格式
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实验技术：RealtimePCR作为在实验室奋斗的“奋青”们，都知道Realtime PCR(RT-PCR)是并列于western blot的基础实验之一。
不会做PCR的人都不好意思说自己在搞科研，呵呵哒。
作为一门核心技术，也是相对来说出结果快速的技术，本次小笔将一改逗比风格，高冷正经脸来分享该技能，各位接好了啊。
RT-PCR原理的话简单来说，就是采用荧光基团标记的特异性探针来跟踪PCR产物，做到全程监控，后期结合电脑软件分析定量得出待测样品的初始量。
步骤如下：1. RNA提取和测定（1）平衡：-80℃取出TRIZOL裂解的细胞（也可以当时裂解；如果是组织，需要超声破碎后再进行后续步骤），置于室温使其完全溶解（3-5min左右）；（2）分离：随后按照裂解液：氯仿（5：1）的比例加入氯仿，剧烈震摇30 S（自认为手劲儿大的就手动摇，扛不住的话也可以涡旋仪，当然我是一直手动的哈哈）后，室温静置3min，4℃，13,000rpm离心10 min，取上清置于干净的RNAfree的EP管中。
【小提示：取上清的时候很容易将中间层的絮状物吸出，导致蛋白质污染，可以采用PhaseLock Gel的离心管，有效分层水相和有机相，避免吸取的上清混杂杂质。
】（3）沉淀：在上清中加入等体积的异丙醇，轻微上下翻动混合，冰上孵育20min后，4℃，14,000rpm离心20 min，管底部有可见沉淀，即为RNA（如果裂解的细胞较少，沉淀可能肉眼看不见）。
（4）清洗干燥：轻柔的倒掉上清，每管加入1 ml 75%乙醇溶液（采用DEPC水配置），混匀，4℃，14,000 rpm离心15 min。
小心倒掉上清，于超净台边缘干燥5min。
（5）溶解测定：根据具体的RNA的量，加入适当的DEPC水溶解（沉淀可见，加入的DEPC水多一些，反之少加），静置后即可于nanodrop检测浓度（一般我们暂定A260/A280比值在1.8-2.0即可使用）。
Real Time PCR实时荧光定量PCR其定量的基本原理是在PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I ）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT 值（Cycle Threshold ）；通过将已知浓度标准品的CT 值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。
荧光定量PCR 技术具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段DNA ，对每克样品中20pg-10ng 的转基因成分进行有效检测。
同时，与Southern 法相比，荧光定量PCR 技术可对T-DNA 的不同序列进行扩增，因此能实现对转基因品系中的基因重组的检测（Giovanna 2002 ）。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。
（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR 方法在研究工作中的运用。
PCR每进行一个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久达到平台期，起始DNA量越多扩增产物量便越早达到检出值，也就是扩增曲线越早起峰，我们将已知浓度的标准品梯度稀释进行real time PCR，就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线，再有Ct值与起始模板数的对数值之间存在的线性关系就可以制作成下图所示的标准曲线。
未知浓度的样品与标准品相同，也可以得到Ct值，并将Ct值带入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是real time PCR的定量原理。
Real Time PCR 检测方法原理■嵌合荧光染料检测法(SYBR Green I)SYBR® Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBR® Green I 荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。
通过PCR反应生成双链DNA，SYBR® Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。
具体原理见下图。
嵌合荧光染料法原理图■双标记荧光探针法双标记荧光探针法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等)，3’端带有淬灭物质（如:TAMRA等）的双标记荧光探针进行荧光检测的方法。
当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。
而当双标记荧光探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。
当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。
进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。
通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。
具体原理见下图。
双标记荧光探针法原理图■ CycleavePCR法原理CycleavePCR法是由RNA和DNA构成的杂合Cycling 探针与RNase H组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出目的基因。
Cycling 探针内部夹有RNA部分，一端标记荧光物质，另一端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。
如果探针的RNA部分与模板不匹配，RNase H就不能在RNA部分将探针切断，所以该检出方法是一种即使一碱基不同也能识别的高特异性检出方法，特别适合于SNP解析。
