检测细胞活性或毒性(Molecular Devices)

MTT法检测细胞活性之阳早格格创做【真验手段】相识体中筛选抗肿瘤药物（细胞毒）的要领，掌握酶标仪的使用要领及MTT真验的本理.【真验本理】MTT是3-（4，5-两甲基噻唑-2）-2，5-两苯基四氮唑溴盐的简称，它是一种能交受氢本子的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使中源性的MTT还本为易溶性的蓝紫色结晶物并重积正在细胞中，而牺牲细胞无此功能.两甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物.正在一定的细胞数范畴内，MTT结晶物的量取细胞数成正比，故用酶联免疫检测仪正在490/570nm波少下测定其吸光值，可间交反映活细胞的数量.体中培植的肿瘤细胞具备无限删殖的功能，正在培植历程中赋予一定浓度的海洋药物，用MTT法不妨精确那些药物是可不妨压造细胞删殖，并比较分歧药物压造效率的强强.【真验器材取药品】人胃癌细胞.细胞用1640培植基（加10%胎牛血浑，100 U/ml青霉素战100mg/ml链霉素）正在37℃、5％CO2鼓战火汽CO2培植箱中惯例培植，细胞传代以0.25％胰酶消化、酶标仪，96孔细胞培植板，加样枪、DMSO，MTT(5mg/ml)【真验要领取步调】1. 将胃癌细胞以5×103/ml稀度交种于96孔板（每孔加200ul），培植至指数死少久（24H），加进分歧浓度的丁酸钠(促进胃细胞死少)（200,120,80,40mM）.每组3个复孔.共时设空黑对于照组.（交种办法如图）2. 24或者48小时后，留神吸来上浑，加进90μl新陈培植液，再加进10ul MTT溶液，继承培植4 h弃上浑，每孔加进100ul两甲基亚砜，置摇床上矮速振荡10 min，使结晶物充分溶解.正在酶联免疫检测仪490 nm 处丈量各孔的吸光值.（CCK-8试剂中含有WST–8：化教名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-两磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它正在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸两甲酯（1-Methoxy PMS）的效率下被细胞线粒体中的脱氢酶还本为具备下度火溶性的黄色甲臜产品（Formazan）.死成的甲臜物的数量取活细胞的数量成正比.用酶联免疫检测仪正在450nm波少处测定其光吸支值，可间交反映活细胞数量.）3. 共时树立调整孔（培植基、MTT、两甲基亚砜），对于照孔（细胞、相共浓度的药物溶解介量、培植液、MTT、两甲基亚砜），每组设定复孔.细胞死少压造率=(对于照组的A值-真验组的A值)/对于照组的A值100 %.【真验截止】1．画造药物对于细胞压造直线2．比较分歧药物对于细胞死少压造情况3．比较共一药物效率分歧时间对于细胞删殖情况的效率【注意事项】1. 由于使用96孔板举止检测，如果细胞培植时间较少，一定要注意挥收的问题.一圆里，由于96孔板周围一圈最简单挥收，不妨采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，火或者培植液；另一圆里，不妨把96孔板置于靠拢培植箱内火源的场合，以慢解挥收.2. MTT溶液为黄色需躲光保存，万古间光照会引导做废.当颜色形成灰绿色时，请勿使用.3. 两甲亚砜溶解液结冻或者爆收重淀时不妨37℃火浴孵育以促进溶解，而且必须正在局部溶解并混匀后使用.【思索题】比较细胞计数取MTT法尝试截止的闭系.。

细胞活力检测方法细胞活力是指细胞的生存状态和生理功能的活跃程度，是评价细胞健康状况的重要指标。

细胞活力的检测方法多种多样，包括形态学观察、生化指标检测、细胞增殖和凋亡检测等。

下面将介绍几种常见的细胞活力检测方法。

首先，形态学观察是最直观的细胞活力检测方法之一。

通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等特征，可以初步判断细胞的活力状态。

健康的细胞通常具有完整的形态结构、清晰的细胞核和丰富的细胞质，而受损或死亡的细胞则可能出现细胞浑浊、变形、脱落等现象。

其次，生化指标检测是常用的细胞活力评估方法之一。

通过检测细胞内的生化指标如ATP含量、蛋白质合成率、酶活性等，可以客观地评价细胞的代谢活力和功能状态。

例如，ATP是细胞内能量的主要来源，其含量的变化可以反映细胞的能量代谢情况，从而间接反映细胞的活力水平。

另外，细胞增殖和凋亡检测也是常用的细胞活力检测方法。

细胞增殖能力是细胞活力的重要指标之一，可以通过细胞计数、增殖标记物检测等方法来评估。

而细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，通过检测细胞凋亡标记物如DNA片段化、凋亡蛋白表达等，可以评估细胞的凋亡程度，从而间接反映细胞的活力状态。

除了上述方法外，还有一些新兴的细胞活力检测技术，如细胞荧光染色、细胞电生理检测、细胞代谢组学分析等，这些方法在评价细胞活力方面具有一定的优势和应用前景。

综上所述，细胞活力的检测方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。

在实际应用中，可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞活力检测，从而更准确地评价细胞的生理状态和功能状态，为细胞生物学研究和临床诊断提供有力支持。

如何借助于具有SpectraMax MinMax300 细胞成像系统的SpectraMax i3多功能微孔板检测平台进行细胞线粒体毒性的检测简介评价待选新药对细胞线粒体产生的毒性作用一直被认为是药物筛选过程中的关键步骤，目前可轻松通过不同颜色的荧光染料来标记细胞线粒体后来检测其活性的变化，整个检测过程中通常也需要结合细胞核复染色法，例如使用DAPI染料，这样就可以在图像中轻松识别出所有细胞。

可以利用成像系统的一个荧光通道识别被染核的细胞，而细胞线粒体活性检测可以通过特定的线粒体染料标记后，来分析第二个荧光通道中每个标记后细胞的荧光信号强度值。

然而，细胞核复染色过程会增加一系列额外的操作步骤，使得实验过程变得繁琐、拖延检测时间。

来自于Molecule Devices公司的StainFree™技术(无标记分析技术)可以解放研究人员，使其无需借助于繁琐的细胞核复染色法来识别细胞，可以直接利用SpectraMax® MiniMax™ 300 细胞成像系统的透射光通道来直接识别出单个细胞。

此篇应用文献重点介绍如何利用SpectraMax® i3多功能微孔板检测平台的细胞成像功能来检测细胞线粒体毒性，缬氨霉素，一种离子型抗生素，可对PC12细胞线粒体功能造成损伤，使用MitoTracker Deep Red FM来标记线粒体后对整个过程进行检测，然后分别使用StainFree方法和细胞核荧光染料标记法对细胞计数，SoftMax Pro软件分析比较两组结果。

SpectraMax MiniMax 300细胞成像系统和SoftMax Pro软件组合后，可以帮助研究人员获取图像信息和进行数据分析，准确、快速的给出潜在化合物对细胞线粒体毒性的浓度效应学曲线。

基于细胞检测试验方法的设置使用含有2.5%胎牛血清、15%的马血清和1%青霉素/链霉素的F-12K培养基来培养PC12(大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞)细胞，在黑色底通的96孔板中每孔加入100ul配好的培养基，细胞的密度为10,000/孔，培养过夜。

MTT法检测细胞活性的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。

MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。

三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS 或生理盐水做溶剂。

市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g。

1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。

具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。

可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。

将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。

按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。

细胞活力检测方法细胞活力是指细胞内外环境稳定，细胞结构完整，代谢活跃，功能正常的状态。

细胞活力的高低直接影响着生物体的生长、发育、免疫功能等多个方面。

因此，准确、快速地检测细胞活力对于生物学研究和临床诊断具有重要意义。

下面将介绍几种常见的细胞活力检测方法。

一、MTT法。

MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。

其原理是将MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物）加入培养基中，MTT会被细胞内的还原酶还原为可溶性的紫色产物，然后用溶剂将产物溶解，最后用酶标仪测定其吸光值。

吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。

二、CCK-8法。

CCK-8法是一种新型的细胞活力检测方法，其原理是将CCK-8（Cell Counting Kit-8）溶液加入培养基中，CCK-8会被细胞内的还原酶还原为橙黄色的产物。

然后用酶标仪测定其吸光值，吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。

相比MTT法，CCK-8法更为灵敏和稳定。

三、荧光染料法。

荧光染料法是一种常用的细胞活力检测方法，其原理是利用荧光染料（如FDA、PI等）染色活细胞和死细胞，然后观察染色情况来判断细胞的活力。

活细胞呈绿色荧光，而死细胞呈红色荧光。

通过计数活细胞和死细胞的比例，可以间接反映细胞的活力情况。

四、细胞代谢物测定法。

细胞代谢物测定法是一种直接反映细胞活力的方法。

通过测定细胞产生的代谢产物（如乳酸、ATP等）的含量，可以客观地评价细胞的活力情况。

这种方法不仅可以用于细胞培养液的检测，也可以用于组织样本的检测。

综上所述，细胞活力的检测方法有多种多样，每种方法都有其独特的优势和适用范围。

在实际应用中，我们可以根据具体情况选择合适的方法来检测细胞活力，以便更好地开展生物学研究和临床诊断工作。

希望本文介绍的内容对您有所帮助。

图2. WST-1、XTT 和MTT 的检测效果比较 注：450nm 为测定波长，690nm 为参考波长WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 产品编号 产品名称 包装C0035 WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 100次产品简介：WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(WST-1 Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-1是一种类似于MTT 的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan (参考图1)。

细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

图1. WST-1检测原理图 (EC=electron coupling reagent ，即电子耦合试剂) WST-1是MTT 的一种升级替代产品，和MTT 或其它MTT 类似产品如XTT 、MTS 等相比有明显的优点。

首先，MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT 、MTS 产生的formazan 都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。

其次，WST-1产生的formazan 比XTT 和MTS 产生的formazan 更易溶解。

再次，WST-1比XTT 和MTS 更加稳定，使实验结果更加稳定。

另外，WST-1和MTT 、XTT 等相比，线性范围更宽，灵敏度更高(参考图2)。

本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等。

本试剂盒检测非常便捷。

无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。

不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤去溶解formazan 。

可以用于大批量样品的检测。

酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

线粒体膜电位指示染料线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件. 它在凋亡过程中与caspase 活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。

基于以上研究，Biotium 研发了各种的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。

MitoView ™ 633MitoView ™ 633 是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料(激发光/发射光622/648 nm)。

使用NucView ™ 488 和MitoView ™ 633 凋亡检测试剂盒可以在荧光显微镜(图.1)或流式细胞仪(图.2、3)下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。

图 1. 使用MitoView ™ 633进行活细胞染色:Hela 细胞图 2. 流式细胞仪分析：Jurkat 细胞一组用CCCP 使线粒体去极化，另一组使用staurosporine 作为凋亡诱导剂。

使用MitoView ™633 染色图3. 流式细胞仪分析：对照（A）与经staurosporine 处理(B)的Jurkat 细胞（JC-1 染色）. FL1 (x- 轴) 为绿色荧光; FL2 (y-轴) 为红色荧光。

(A 图) 较高的红绿荧光比例表明线粒体膜电位未下降. （B 图）较低的红绿荧光比例说明：由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。

JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的变化。

在健康细胞中,JC-1以聚合体(J-aggregates)，的形式存在在线粒体基质中，可以产生红色的荧光(激发光/发射光585/590nm)。

相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光( 激发光/ 发射光510/527nm)，这样可以使用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。

常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

贮藏条件残留。

为使CCK - 8试剂和培养基充分混匀，建议在加 入CCK - 8试剂后轻轻振摇培养板。

为了避免加样时由 于CCK - 8试剂在枪头上的残留所带来的误差，可以在 加样前用培养基稀释CCK - 8试剂并混匀后加样。

- 8甲臜，如果实验中有还原剂，请检查背景的O.D值， 即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK - 8试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比 较 (只加CCK - 8试剂)，如果O.D值明显偏高，则说明 有反应。

变化，建议更换新鲜的培养基后再加CCK - 8试剂。

含 有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。

600 nm以上) 作为参比波长，扣除参比波长的O.D值即可。

的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在CCK - 8法 检测完后继续进行。

线 ( 具体方法参见P.3页的“制作标准曲线”)。

量和加入CCK - 8试剂后的培养时间。

来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔 就混匀一下。

培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为 了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而 不作为指标检测孔。

少而异。

一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长 的CCK - 8反应时间或增加细胞数量 (～105个细胞/孔)。

悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。

对于悬浮细胞， 在加入CCK - 8培养1- 4小时后，可先从培养箱中取出， 目测染色程度或用酶标仪测定决定。

若显色困难，可 将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。

对 于贴壁细胞，CCK - 8的培养时间一般为1- 4小时，但 在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度 (根据 细胞种类而定，需要摸索一下条件)。

注意：CCK - 8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。

行孔间的差异。

加 CCK - 8试剂时，建议斜贴着培养 板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡， 会干扰O.D值读数。

1 234567810注意事项：- 100 孔: 1 ml x 1 管试剂内含所需设备和材料：概述参考资料操作说明参考资料Q&A:。

优势：利用SpectraMax i3x多功能微孔板读板机所具有的超灵敏化学发光检测功能进行细胞活力和细胞毒性的评价简介方法 准备试剂• 仪器具有超高灵敏度化学发光检测功能，最低至10个细胞/每孔；• 微孔板读板高度自动优化设置，可提高检测信号强度• 软件预置模板可以更快分析出检测结果SpectraMax i3x是Molecular Devices公司最新推出的一款多功能微孔板读板机，可利用仪器所具有的化学发光检测功能，进行细胞活力和细胞毒性相应检测。

仪器可灵敏、快速检测出培养基中活细胞的数目和经相应处理后细胞毒性情况。

Promega公司推出的CellTiter-Glo试剂是利用了萤火虫荧光素酶反应体系中需要ATP参与才能使其发光的特点，化学发光信号强弱取决于培养基中ATP含量的高低，也就是依赖于其中活细胞数目的多少。

来自于BioVision公司基于生物化学发光原理的细胞毒性检测试剂盒，目的是检测腺苷酸激酶(AK)的含量，AK为一种存在于所有细胞中的常见蛋白，当破坏了细胞膜完整性后其会释放至培养基中，AK可转化ADP至ATP，所以可以利用类似方式进行化学发光检测。

材料• CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay (Promega P/N G7570)• Bioluminescence Cytotoxicity AssayKit (BioVision P/N K312-500)• HeLa 细胞(ATCC P/N CCL-2)• 黑色底透 96孔细胞培养板 (Corning P/N3904)• 白色96孔细胞培养板(Corning P/N 3917)• SpectraMax i3x多功能微孔板读板机使用前预先将CellTiter-Glo缓冲液和底物解冻并且平衡其至室温，将CellTiter-Glo 缓冲液加至含有CellTiter-Glo底物的棕色小瓶中，按照试剂盒说明书提示，将试剂轻轻反复颠倒进行混匀。

介绍在SpectraMax ® L和SpectraMax ®M5酶标仪上应用Promega CellTiter-Glo化学发光法检测细胞活性MD公司的SpectraMax ® L及SpectraMax ® M 5型号酶标仪结合P r o m e g a 公司的CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒能进行快速灵敏的活细胞数量测定。

CellTiter-Glo检测法使用了萤光素酶，需要ATP使其反应发光。

发光信号强度由ATP量决定，而ATP的多少取决于活细胞数目。

SpectraMax ® L及M5酶标仪均能提供96孔和384孔化学发光检测功能。

方法准备CellTiter-Glo试剂使用前将CellTiter-Glo缓冲液和底物在室温中平置解冻。

然后将缓冲液倒入装有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手册中指示，温和颠倒瓶子以混匀。

细胞计数及产生发光信号用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham ’s F12培养基培养CHO-K1细胞。

胰酶消化后使细胞悬浮在培养基中，并进行细胞计数。

用96孔板检测时，每孔中加入100ul细作者 Cathy Olsen, Ph.D., MDS Analytical Technologies,1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089.材料：1.CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒(Promega公司，货号G7570)，包括CellTiter-Glo缓冲液和CellTiter-Glo底物(冻干粉)CHO-K1细胞(ATCC，货号CCL-61)白色96和384孔板(Greiner Lumitrac 200，货号655075和781075)SpectraMax ® L化学发光微孔板检测仪或SpectraMax ® M5多功能微孔板读板机胞悬液，细胞浓度从50000个/孔稀释到24个/孔。

细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。

有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。

细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。

2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。

二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。

当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。

该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。

特点： 1）简单、快速。

2）板式检测，可进行高通量。

三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。

通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。

细胞增殖-毒性检测实验操作步骤
CCK8试剂盒，是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。

CCK法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

下面以engreen的CCK8试剂盒为例，简要说明细胞增殖-毒性检测的操作步骤
方法/步骤
1. 在96孔板中配制100μl的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养 24 小时 (在37℃，5% CO2 的条件下)。

2. 向培养板加入10μl 不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48 小时)。

4. 向每孔加入10μl CCK8 溶液（engreen） (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数)。

5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

6. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

7. 如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在24小时内吸光度不会发生变化。

超灵敏型CCK-8（细胞活力/毒性检测）试剂盒说明书超灵敏型CCK-8细胞活力测定试剂盒是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性相对定量及绝对定量检测的快速、高灵敏度试剂盒，比传统的MTT、XTT及CCK-8方法具有更好的检测灵敏度和更宽的线性范围。

产品优势：本试剂盒检测非常便扰。

试剂盒仅一管已经配制好的超灵敏型CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作。

无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。

不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解反应生成物，可用于大批量样品的高通量检测。

使用方法：1、使用96孔板，细胞培养和处理完毕。

2、逐孔加入超灵敏型CCK-8试剂，每孔100μl培养基中加入10μl超灵敏型CCK-8试剂。

3、培养板放回培养箱，37℃孵育1~4小时。

4、于49Onm处测定OD值。

5、结果分析将各测试孔的OD值减去对照孔OD值。

各平行孔的OD值取平均数。

细胞活力％二（加药细胞OD-空白OD）/（对照细胞OD-空白OD）×100%6、若使用除96孔外的培养板，试剂用量按照培养基体积等比例增减。

使用注意事项：1、试剂加入后需轻轻振摇培养板，使超灵敏型CCK-8试剂与培养基充分混匀。

2、试剂加入后培养时间根据细胞种类的不同和每孔细胞数量的多少而异。

对于贴壁细胞，加入超灵敏型CCK-8的培养时间一般为1~4小时,但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度（根据细胞种类而定）。

与贴壁细胞相比，悬浮细胞较难显色。

对于悬浮细胞，在加入超灵敏型CCK-8培养1~4小时后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定。

若显色困难，可以将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。

3、如果实验中有还原剂，需要检查背景的OD值，即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入超灵敏型CCK-8试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较（只加超灵敏型CCK-8试剂），如果OD值明显偏高，则说明有反应。

介绍在SpectraMax ® L和SpectraMax ®M5酶标仪上应用Promega CellTiter-Glo化学发光法检测细胞活性MD公司的SpectraMax ® L及SpectraMax ® M 5型号酶标仪结合P r o m e g a 公司的CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒能进行快速灵敏的活细胞数量测定。

CellTiter-Glo检测法使用了萤光素酶，需要ATP使其反应发光。

发光信号强度由ATP量决定，而ATP的多少取决于活细胞数目。

SpectraMax ® L及M5酶标仪均能提供96孔和384孔化学发光检测功能。

方法准备CellTiter-Glo试剂使用前将CellTiter-Glo缓冲液和底物在室温中平置解冻。

然后将缓冲液倒入装有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手册中指示，温和颠倒瓶子以混匀。

细胞计数及产生发光信号用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham ’s F12培养基培养CHO-K1细胞。

胰酶消化后使细胞悬浮在培养基中，并进行细胞计数。

用96孔板检测时，每孔中加入100ul细作者 Cathy Olsen, Ph.D., MDS Analytical Technologies,1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089.材料：1.CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒(Promega公司，货号G7570)，包括CellTiter-Glo缓冲液和CellTiter-Glo底物(冻干粉)CHO-K1细胞(ATCC，货号CCL-61)白色96和384孔板(Greiner Lumitrac 200，货号655075和781075)SpectraMax ® L化学发光微孔板检测仪或SpectraMax ® M5多功能微孔板读板机胞悬液，细胞浓度从50000个/孔稀释到24个/孔。

细胞增殖及细胞活力检测方法目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。

一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。

另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。

显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。

如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。

所以最直接的证据应该采用方法一。

用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。

若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。

但更为常用的方法是BrdU检测法。

用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。

细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。

Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。

比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。

而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。

1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。

BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。

有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。

细胞活性测定方法细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。

核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。

而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。

因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。

另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。

代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。

使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。

通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。

FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。

前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。

后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。

正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。

不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。

用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。

缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。

常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。

其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。

但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。