MTT法检测细胞毒性

细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。

有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。

细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。

2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。

二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。

当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。

该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。

特点： 1）简单、快速。

2）板式检测，可进行高通量。

三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。

通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。

小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法一、本文概述本文旨在探讨MTT法（四唑盐比色法）在细胞增殖抑制率测定中IC50（半数抑制浓度）的计算方法。

MTT法是一种广泛应用于生物学、医学等领域的细胞增殖与细胞毒性检测方法，其原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

因此，通过测定甲瓒的生成量，可以间接反映活细胞数量。

而IC50作为评价药物对细胞增殖抑制效果的关键指标，其准确计算对于药物研发、药效评价以及临床用药等方面具有重要意义。

本文将首先介绍MTT法的基本原理和实验步骤，然后重点阐述IC50的计算方法，包括线性回归法、概率单位法等多种方法，并对各种方法的优缺点进行评述。

本文还将讨论影响IC50计算准确性的因素，如实验条件、细胞类型、药物浓度范围等，并提出相应的改进措施。

本文将总结MTT法测细胞增殖抑制率中IC50计算方法的实际应用和前景展望，以期为相关领域的研究提供有益的参考和借鉴。

二、MTT法测细胞增殖抑制率的实验步骤细胞准备：选择适合实验需求的细胞系，并进行传代培养至对数生长期。

确保细胞状态良好，无污染，并且有足够的数量用于实验。

药物准备：根据实验需求，选择待测试的药物，并按照预定的浓度范围进行稀释。

通常，药物浓度设置应覆盖多个数量级，以便更准确地测定IC50值。

细胞接种：将细胞以适当的密度接种到96孔板中。

确保每孔细胞数量一致，以便后续实验结果的准确性。

药物处理：向每个孔中加入不同浓度的药物，同时设置对照组（无药物处理）和空白组（无细胞，仅培养基）。

每个浓度通常设置多个复孔，以减少实验误差。

培养：将96孔板放入培养箱中，按照细胞生长所需的条件进行培养。

培养时间根据细胞类型和实验需求而定，通常为24-72小时。

MTT处理：在培养结束前4小时，向每孔中加入MTT溶液（通常为5mg/mL）。

MTT会被活细胞中的线粒体还原成紫色甲瓒晶体，从而反映细胞的存活情况。

MTT原理方法及操作步骤MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种常用的细胞增殖测定试剂，用于定量测定细胞的存活情况。

MTT的工作原理：MTT原理是基于还原型特种金属试剂Florida Cyanide。

MTT可进入细胞内部，被活细胞内的膜连蛋白酶还原为水溶性紫色化合物，甲基化噻唑胺盐（formazan）。

甲基化噻唑胺盐可溶于有机溶剂如DMSO或乙醇。

MTT的量越多，被还原为甲基化噻唑胺盐越多，即细胞活性越高。

MTT的操作步骤：1.预处理细胞将需要检测细胞的培养基倒入培养皿中，将获得的细胞悬液加入培养基中，根据实验要求进行设定浓度和培养时间。

2.处理试剂根据常规的MTT工作浓度（通常为0.5 mg/ml），将MTT试剂精确称取并溶解在无菌的溶剂（例如PBS）中。

3.细胞处理将培养中的细胞培养液抽取约100μl至新的96孔板孔中，并注意控制每个孔中细胞数相同时的培养基体积。

4.加入MTT试剂将所制备的MTT溶液以100μl的体积的溶液加入到培养细胞上，并尽量在操作中迅速搅拌均匀，以使MTT均匀分布。

5.细胞孔板孔的处理将MTT试剂添加到孔中后，覆盖板密封（如用保鲜膜密封）。

然后将培养皿放入暗处，37°C培养孔中的细胞进行inculbation与MTT碳酸酯酶的反应。

通常培养12至24小时，可以根据具体实验情况延长培养时间。

6.细胞孔中溶解甲基化噻唑胺盐将培养平皿中的培养液取出约50μl，悬浮溶解掉的甲基化噻唑胺盐，再加入200μlDMSO混合均匀。

7.测定吸光度将孔中的溶液分别转移到透明壁的96孔板，并使用微孔板阅读装置（Multiskan Spectrum）在570 nm波长下测定吸光度。

DMSO溶液作为空白参照，用作光强的基准。

8.数据分析根据检测吸光度得到的数据，计算出每个孔的平均值，并根据实验要求，进行数据图表分析。

总结：MTT法是一种可靠、灵敏、简单、可重复性好的细胞增殖测定方法。

产品简介：1. MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的实验方法。

由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此常常用来检测细胞的增殖情况。

MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。

在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。

然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。

细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。

2. 本试剂盒采用了独特的Formazan溶解液配方，无需去除原有的培养液，可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。

从而避免了由于去除培养液时formazan被部分去除而引起的误差。

3. 本试剂盒背景低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便提高了可靠性。

4. 本产品为500 次（5个96孔细胞培养板）操作。

产品内容：MTT染色液5mlFormazan溶解液55ml说明书1份保存条件：MTT染色液需-20℃避光保存；Formazan溶解液可以室温保存。

注意事项：1. 由于使用96孔板进行检测，如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。

因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了2. MTT溶剂在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

3. MTT一般最好4ºC避光保存两周内有效，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

4. Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。

5. 孵育时，须避光6. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。

MTT法原理步骤细胞的增殖检测（MTT法）MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长)，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 ，定容1L）4、DMSO（二甲基亚砜）5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

MTT法实验步骤MTT法是一种常用的细胞增殖试验方法，适用于评价化合物、毒性物质等对细胞增殖和生长状态的影响。

接下来介绍MTT法的实验步骤。

步骤一：细胞预处理在进行实验之前，需要对细胞进行预处理。

首先，准备好需要的细胞品种，如HUVEC、HeLa等。

将细胞分装入培养皿中，接种到适宜的培养基中进行生长，培养条件包括暗、湿润、细胞所需的适宜温度和CO2浓度等。

细胞的种植密度因品种而异，需根据实验要求确定。

步骤二：处理试样用需要测定细胞的生长状态的化合物或药物浓度制备一系列的试验处理液。

加入选定的浓度改变试验物的细胞培养基中，使培养液和细胞充分接触，最终使改变的剂量溶液和细胞达到相互作用和影响的平衡状态。

对照组应该包括无药物处理组、阳性对照组和阴性对照组。

步骤三：MTT染色生物学分析的结果主要通过着色反应证实。

选择细胞培养1天至3天后的生长期，取出细胞培养硅水形成的单层细胞，将试验处理液完全移去，倒入一定浓度的MTT染料（约为5mg/ ml）的培养皿中，混匀后放回培养箱中培养。

MTT染料在体外具有还原性，其主要成分为黄色水溶性四磺基偶氮苯（MTT）和紫色可相溶物态可由于细胞增殖产生的相应蓝色多聚物。

MTT染液不仅具有良好的穿透性和选择性，而且可定量测定，适用于不同的细胞系统和不同种类的化合物。

步骤四：形成水溶性紫色产物经过一定时间（约2-4小时）培养后，将培养皿中MTT染色液吸出，然后加入DMSO。

MTT染色液中的紫色物质由细胞代谢经水解而变成水溶性紫色产物，最后可通过龙头苏作用的吸波测定在492nm处检测吸收光强，并且不受外界因素干扰。

得到各个试验条件下的吸收值后，可通过软件计算出各个试验条件下的相应生长率，以求得影响细胞增殖状况的药物剂量，进一步评价其生物学活性。

综上所述，MTT法的实验步骤比较简单，但是实验操作需规范严格。

掌握好实验步骤，才能更好地进行生物学分析和评价药物、毒物等对细胞增殖和生长的影响。

MTT的操作‎方法一、MTT是什么‎MTT是一种‎粉末状化学试‎剂，全称为3-(4,5)-dimeth‎y lthia‎h iazo (-z-y1)-3,5-di- phenyt‎e trazo‎liumro‎m ide，汉语化学名为‎3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑‎溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色‎的染料。

二、MTT法用来‎做什么简单地说：是一种检测细‎胞存活和生长‎的方法。

MTT主要有‎两个用途1．药物（也包括其他处‎理方式如放射‎线照射）对体外培养的‎细胞毒性的测‎定；2．细胞增殖及细‎胞活性测定。

三、为何MTT可‎以用来做上述‎工作检测原理为活‎细胞线粒体中‎的琥珀酸脱氢‎酶能使外源性‎M TT还原为‎水不溶性的蓝‎紫色结晶甲瓒‎（Formaz‎a n）并沉积在细胞‎中，而死细胞无此‎功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中‎的甲瓒，用酶标仪在490nm‎波长处测定其‎光吸收值，在一定细胞数‎范围内，MTT结晶形‎成的量与细胞‎数成正比。

根据测得的吸‎光度值（OD值），来判断活细胞‎数量，OD值越大，细胞活性越强‎（如果是测药物‎毒性，则表示药物毒‎性越小）。

四、实验所需材料‎1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度‎为5mg/ml,须用PBS或‎生理盐水做溶‎剂。

市面上一般M‎T T的包装为‎100mg,250mg或‎1g1.1对于100‎m g这样的小‎包装，厂家都是将M‎T T放入小管‎中的，个人建议不要‎再用天平称量‎分装，而应该一次性‎将其全配制成‎溶液，如100mg‎用20mlP‎B S来溶解。

具休做法：预先在50m‎l离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml‎PBS，从中先吸取5‎00-1000u l‎PBS装入含‎M TT的小管‎中，吹打若干次后‎将其移入50‎m l离心管，然后再混匀。

可以重复几次‎，以使小管中的‎M TT不残留‎于管内。

简述mtt法能绘制细胞生长曲线的原理
MTT法（即3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种常用的细胞代谢活性检测方法，常用于测定细胞增殖与毒性的活性。

MTT法的原理是通过将MTT激发后生成的水溶性产物还原成紫色的颗粒沉淀，进而通过溶解颗粒沉淀来评估细胞数量和代谢活性。

主要步骤如下：
1. 细胞接种：将待测细胞接种在含有MTT试剂的培养皿中。

2. 细胞培养：细胞在MTT试剂中进行培养，培养期间细胞会代谢活跃并增殖。

3. 溶解颗粒沉淀：经过一定时间的培养后，MTT试剂会被还原成紫色的颗粒沉淀。

将培养皿中的培养液倒掉，然后加入溶解剂（如酒精或二甲基亚硫酸钠溶液）溶解颗粒沉淀。

4. 颜色测定：溶解颗粒沉淀溶解后的溶液会变成紫色，利用酶标仪或多孔板读取器测定溶液的光密度。

MTT法通过测定光密度来间接评估细胞的增殖与活性。

细胞越多，MTT试剂被还原成颗粒沉淀就越多，溶解后的溶液光密度就越高，说明细胞数目越多，代谢活性越高。

因此，通过测定光密度的变化可以绘制细胞生长曲线，反映细胞增殖与活性的变化情况。

mtt评价法摘要：1.MTT 评价法的定义和背景2.MTT 评价法的核心理念3.MTT 评价法的具体操作步骤4.MTT 评价法的优点和局限性5.MTT 评价法在实际应用中的案例分析正文：一、MTT 评价法的定义和背景MTT 评价法，全称“最小肿瘤杀伤浓度评价法”，是一种用于评估抗肿瘤药物活性的实验方法。

该方法起源于20 世纪60 年代，由美国国立癌症研究所（NCI）的Murray 等人首次提出。

其目的是为了在药物筛选阶段，找到对肿瘤细胞具有最佳杀伤效果的药物，同时确保药物对正常细胞的毒性较低。

二、MTT 评价法的核心理念MTT 评价法的核心理念是通过测量药物对肿瘤细胞和正常细胞的毒性来评估药物的活性。

该方法基于细胞呼吸的原理，通过检测细胞内的脱氢酶活性来判断细胞是否存活。

三、MTT 评价法的具体操作步骤1.细胞种植：首先将肿瘤细胞种植在96 孔板中，每孔细胞数量适宜。

然后将不同浓度的药物加入不同孔的培养液中。

2.培养：将96 孔板放入培养箱中，按照实验要求进行培养。

3.检测：培养一定时间后，取出96 孔板，加入MTT 溶液，继续培养1-4 小时。

4.酶标仪检测：用酶标仪检测各孔中MTT 的吸光度，以反映细胞存活率。

5.数据处理：以药物浓度为横坐标，MTT 吸光度为纵坐标，绘制剂量- 反应曲线，计算半数抑制浓度（IC50）和95% 抑制浓度（IC95）。

四、MTT 评价法的优点和局限性优点：1.操作简单，易于实现自动化；2.可以快速评估药物的活性；3.对细胞类型和药物种类适用性广泛。

局限性：1.不能完全反映药物在体内的药效和毒性；2.对细胞状态要求较高，细胞状态不佳时，结果可能不准确；3.受试剂质量、操作方法等因素影响较大。

五、MTT 评价法在实际应用中的案例分析案例：研究某种新型抗肿瘤药物X 对肺癌细胞A549 的活性。

步骤：1.将A549 细胞种植在96 孔板中，每孔细胞数量适宜。

2.将不同浓度的药物X 加入不同孔的培养液中。

产品简介：1. MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的实验方法。

由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此常常用来检测细胞的增殖情况。

MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。

在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。

然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。

细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。

2. 本试剂盒采用了独特的Formazan溶解液配方，无需去除原有的培养液，可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。

从而避免了由于去除培养液时formazan被部分去除而引起的误差。

3. 本试剂盒背景低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便提高了可靠性。

4. 本产品为500 次（5个96孔细胞培养板）操作。

产品内容：MTT染色液5ml Formazan溶解液55ml 说明书1份保存条件：MTT染色液需-20℃避光保存；Formazan溶解液可以室温保存。

注意事项：1. 由于使用96孔板进行检测，如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32 个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。

因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了2. MTT溶剂在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

3. MTT一般最好4ºC避光保存两周内有效，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

4. Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。

5. 孵育时，须避光6. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。

Hotline ：400-6111-883 E -上HB210525本产品仅作科研用途！MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒Cat NO.40206产品说明书网址： 第1页，共2页MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒产品信息MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒40206ES76 500 T 40206ES80 1000 T 40206ES905000 T产品描述噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl -tetrazolium bromide , MTT ），也称作溴化噻唑蓝四氮唑，是一种黄色染料，已经普遍替代传统的台盼蓝染色法或者放射性同位素插入法，用来检测细胞的活力，细胞增殖以及细胞毒性分析。

检测原理在于：MTT 是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT 还原成为水不溶性的深蓝色MTT -甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。

甲臜结晶是不能穿透细胞膜，因此沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。

甲臜结晶可用DMSO 或者酸化的异丙醇溶解出来，酶标仪下测定570 nm 的吸光度反映甲臜的生成量。

而甲臜的生成量与活细胞数目成正比，用以评估细胞存活状况。

本试剂盒以MTT （高纯度）作为指示剂，在经典操作步骤的基础上，采用独特的甲臜溶解液配方，可以直接溶解甲臜沉淀，无需去除原有的培养液。

从而避免因去除培养液时甲臜被部分去除而引起的操作误差。

具有本底低，灵敏度高，线性范围宽，操作简单等特点。

另外，本试剂盒还提供配套的一次性针头过滤器和注射器，为实验带来更多的便利。

产品组分编号 组分 产品编号/规格40206ES76（500T ） 40206ES80（1000T ） 40206ES90（5000T ） 40206-A MTT 粉末 25 mg 50 mg 250 mg 40206-B MTT 溶剂 5 mL 10 mL 50 mL 40206-C 甲臜溶解液 50 mL 100 mL 100 mL×5 40206-D除菌套装1包1包1包运输和保存方法冰袋运输。

MTT_CCK8法细胞活力检测及药物IC50计算MTT_CCK8法是一种常用的细胞活力检测方法，用于评估细胞对其中一种处理或药物的反应。

通过该方法，可以测量细胞的代谢活性和细胞数量的变化，从而评估药物的细胞毒性或抑制效果。

本文将详细介绍MTT_CCK8法的原理、操作步骤以及药物IC50值的计算。

MTT_CCK8法的原理是基于细胞色素氧化酶催化反应，利用MTT（3-(4,5-二甲基硫磷酰基)-2,5-二苯基四唑）或CCK8（Cell Counting Kit-8）试剂盒将细胞内活力转化为可测量的紫色产物，然后通过比色测定试剂的吸光度变化，间接反映细胞活力的变化。

1.细胞培养和处理：将待测的细胞株接种在增殖培养基中，以适当的密度培养至对数期。

根据实验需求，对细胞进行不同处理，如药物处理、基因转染或不同的培养条件等。

2.细胞接种：将培养好的细胞以恰当的浓度均匀地接种在96孔板中，每孔加入适量的培养基。

3.细胞处理：根据实验设计，在孔中加入处理组的药物溶液，对照组则加入等量的溶剂（如PBS）。

4.MTT或CCK8试剂的添加：根据MTT或CCK8试剂盒的说明书，向每孔中加入适量的MTT或CCK8试剂，使其与细胞共培养。

5.细胞孵育：将96孔板放入培养箱中，以适当的条件孵育一段时间（通常为1-4小时），使细胞与MTT或CCK8试剂发生反应。

6.终止反应：取出96孔板，倒掉培养基，并轻轻洗涤1-2次，以去除未被细胞吸收的试剂。

7.溶解结晶体：加入适量的溶解剂（如DMSO）到每孔中，使形成的结晶体溶解为紫色水溶液。

8. 混匀和测定：用振荡器或摇床使溶液充分混匀，然后使用ELISA Reader等光度计测定试剂的吸光度，通常在570 nm或490 nm处进行测定。

计算药物IC50值的方法如下：1.统计各处理组和对照组的均值和标准差。

2.将各组的吸光度值减去对照组的吸光度值，得到净吸光度。

3.将净吸光度与药物浓度进行回归分析，绘制药物浓度与细胞活力百分比的曲线。

MTT/CCK8法细胞活力检测及药物IC50计算1 细胞活力检测目的2 MTT/CCK8实验原理与方法目录3 数据分析与注意细节4 药物IC50的计算细胞增殖与细胞毒性细胞活力（Cell Viability）：细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比。

细胞活力检测通常包括细胞增殖检测和细胞毒性检测。

细胞增殖是活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。

细胞的增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。

细胞毒性是由药物或化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。

Drug/Ray细胞增殖示意图细胞毒性示意图细胞活力检测的目的检测目的：1）由组织中分离细胞检查活力以了解分离过程对细胞是否有损伤作用。

2）复苏后的细胞也要检查细胞活力，了解冻存和复苏的效果。

3）细胞毒性检测，明确药物或射线等对细胞毒性的影响。

4）细胞增殖能力检测，基因上调或下调后对细胞增殖能力的影响。

对照组实验组计算公式：细胞存活率=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数×100%直接计数法：利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对各组细胞数目进行比较。

优点：简单，不需要特定的仪器和试剂；准确。

缺点：不适合样本数量多的情况。

胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法：TdR是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。

用同位素H标记TdR即H-TdR作为DNA合成的前体能渗入DNA合成代谢过程，通过测定细胞DNA链内标记核苷酸的量的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。

优点：敏感性高，容观性强，重复性好。

缺点：需要一定设备条件，存在放射性核素污染问题。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）检测法：Brdu是胸腺嘧啶（T）的衍生物，可代替T在DNA合成期（S期）掺入DNA链，活体注射或细胞培养加入，而后利用特异性抗体，显示增殖细胞。

同时结合其他细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类、增殖速度等。

细胞毒性实验下午铺板，次⽇上午加药.⼀般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2，37℃孵育16-48⼩时，倒置显微镜下观察。

4.每孔加⼊20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

若药物与MTT 能够反应，可先离⼼后弃去培养液，⼩⼼⽤PBS冲2-3遍后，再加⼊含MTT的培养液。

5.终⽌培养，⼩⼼吸去孔内培养液。

6.每孔加⼊150ul⼆甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7.同时设置调零孔（培养基、MTT、⼆甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、⼆甲基亚砜）悬浮细胞：1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补⾜的1640（⽆⾎清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul⽤培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加⼊到96孔板（边缘孔⽤⽆菌⽔填充）。

每板设对照（加100?(储存液100 1640）。

2）置37℃，5%CO2孵育16-48⼩时，倒置显微镜下观察。

3）每孔加⼊10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。

（悬浮细胞推荐使⽤WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4）离⼼（1000转x10min），⼩⼼吸掉上清，每孔加⼊100 ul⼆甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

5）同时设置调零孔（培养基、MTT、⼆甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、⼆甲基亚砜），每组设定3复孔。

·258·不同浸提容器对MTT 体外细胞毒性的影响王宁宁　通标标准技术服务（上海）有限公司　上海　200030摘　要：体外细胞毒性测试具有很好的通用性，广泛适用于各种医疗器械和材料的评价，为ISO10993…所推荐，其中浸提液实验法操作便利，使用范围比较广。

影响MTT细胞毒测试的影响因素多样，本文则探讨浸提容器对MTT细胞毒性测试的影响。

关键词：细胞毒性　MTT法　浸提容器MTT法体外细胞毒性的检测原理是：在活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素C作用下，MTT被还原成甲臜，死细胞缺失琥珀酸脱氢酶，不能将MTT还原，一定测试条件下，甲臜的生成量和样本中的活细胞数目成正比。

甲臜是不溶于水溶于醇类的蓝紫色结晶体，MTT通过用测定甲臜溶于醇类后的色度来判断细胞的存活率。

在浸提液实验法使用浸提容器对样品，阳性对照，阴性对照进行浸提，浸提应在洁净，化学惰性，密封的容器中进行。

如果浸提容器析出物质有细胞毒性或者析出还原性物质，会很大程度影响实验的准确性。

而硼硅酸盐玻璃因其化学惰性，且容易清洁被认为是相对理想的浸提容器，但如测试样品大小形状各异，玻璃容器大小和规格有限很难满足多样形状的样品浸提需求，因此，可以随意折叠大小的一次性使用的混合聚乙烯材料的无菌袋使用更灵活。

本文通过比较硼硅酸玻璃容器，混合聚乙烯无菌袋对MTT测试的影响，为选择合适的浸提容器进行MTT法细胞毒性测试参考。

1材料与方法1.1…材料1.1.1…材料和试剂小鼠肺纤维细胞L929来源于美国菌种保藏中心；MEM来源于Gibco；胎牛血清（FBS）来源于Gibco；抗生素P-S来源于Gibco；MTT:…来源于Sigma-Aldrich中国；阴性标准片：高密度聚乙烯偏（HPDE）；完全培养基：MEM含10%胎牛血清含1%…P-S。

1.1.2…仪器和设备生物安全柜，新加坡艺思高科技有限公司（ESCO）；CO2培养箱，赛默飞世尔科技公司；恒温摇床,…赛默飞世尔科技公司；酶标仪，Molecular…Devices1.2…方法1.2.1…实验方法空白对照:取适量完全培养基放入浸提容器中，于37℃摇床中持续摇晃（120rpm）24小时。