实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定

核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。

2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。

3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。

4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。

二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。

核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。

DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。

酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。

盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。

RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。

Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。

核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。

紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。

A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。

琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。

三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。

大肠杆菌菌液。

2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。

酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。

无水乙醇、75%乙醇。

3M 醋酸钠（pH 52）。

Trizol 试剂。

异丙醇。

RNA 酶抑制剂。

琼脂糖。

50×TAE 电泳缓冲液。

核酸染料（如 EB 或 GelRed）。

动物组织中核酸的提取与组分的鉴定[适用对象]药学、药物制剂、中药学、中药学（国际交流方向）、制药工程、中药学（知识产权保护方向）、生物工程专业[实验学时] 4学时一、实验目的掌握核酸分离的方法及各成分的鉴定，熟悉台式离心机的使用，并学会小鼠的处死。

二、实验原理组织细胞中的核酸大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。

核蛋白被三氯醋酸沉淀后，用10%NaCl溶液提取核酸的钠盐，再加入乙醇可使核酸钠沉淀析出。

核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）均可被硫酸水解产生磷酸、碱基（嘌呤和嘧啶）和戊糖（RNA含核糖，DNA含脱氧核糖）。

此三类化合物可用下述方法鉴定之。

1、磷酸与钼酸铵作用产生磷钼酸，后者在还原剂氨萘酚磺酸作用下形成蓝色的钼蓝。

2、嘌呤与硝酸银产生灰褐色的嘌呤银化合物。

3、核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生成糖醛，后者和3，5-二羟甲苯缩合而成绿色化合物。

4、脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟（基）-γ-酮（基）戊醛，它与二苯胺作用生成蓝色化合物。

三、仪器设备台式离心机四、相关知识点核酸组成知识；化学呈色反应知识；离心技术知识。

五、实验步骤（一）制备匀浆将小白鼠1只，拉断脊椎致死，剖腹取出全部肚组织；用清水冲净血污后，用滤纸吸干，用剪刀剪碎，再加0.9%NaCl 溶液2ml于研钵中制成匀浆。

（二）分离提取取全部匀浆于离心管（或小试管）内，加2%三氯醋酸2ml，用玻璃顶替搅匀，静置3分钟，3000转/分离心3分钟。

3000转/分离心3分钟。

弃上清液，于沉淀中加入10%NaCl2ml，充分混匀；置沸水浴中加热8分钟，用玻璃顶替边加热边搅拌（防止玻管底破裂），使之充分生成核酸钠化合物。

取出放冷，3000转/分离心3分钟。

将上清液倒入另一试管内，逐滴加入95%冷乙醇2ml，边加边搅拌，待析出白色沉淀。

静止5分钟后，再3000转/分离心5分钟，倾去上清液后沉淀备用。

（三）核酸水解于上述白色沉淀（核酸钠）中加入5%H2SO4溶液4ml，用玻璃棒搅匀，在沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液。

核酸的提取与鉴定实验报告
实验报告：核酸的提取与鉴定
I. 实验目的：
通过实验学习核酸提取和鉴定的步骤，掌握核酸提取实验技能，初步了解PCR技术及其在分子生物学中的应用。

II. 实验原理：
DNA分子在水性条件下具有极强的极性，由此，在化学性质上只要是极性且亲水性的溶剂都能迅速膨胀和破裂DNA分子的双链
结构，并溶解其中的碱基、核苷酸、脱氧糖等。

利用这一原理，
我们可以用溶液来提取含有核酸的样品，然后通过紫外吸光度计
检测该提取物中核酸的含量。

此外，PCR技术是一种被广泛运用
于DNA扩增的技术，其主要原理是通过DNA聚合酶扩增DNA
的特定片段。

III. 实验步骤及结果：
1. 核酸提取：将实验样品加入细胞破解液并混匀，离心后取上
清液，加入等体积的异丙醇，轻轻振荡混合并离心15分钟，然后
弃上清液，加入70%无水乙醇并离心，倒掉液体后用氧气吹干。

最终的核酸提取物的溶解液浑浊且无法肉眼辨认样品。

2. 核酸鉴定：将已经提取的样品分别用紫外吸光度计测量其光密度，结果表明与对照的D.W相比，样品中的核酸具有极高的光密度值，证明核酸提取步骤成功，核酸鉴定实验成功。

IV. 结论：
通过本次实验，我们成功地提取了样品中的核酸，并对提取后的核酸进行了鉴定，证明提取物中含有大量的核酸，表明核酸提取和鉴定实验成功，也为分子生物学的研究提供了基础。

肝脏DNA提取实验报告实验目的本实验旨在通过提取肝脏组织中的DNA，以便进一步研究和分析肝脏的遗传信息。

实验材料1.新鲜肝脏组织样本2.细胞裂解缓冲液3.蛋白酶K4.脱氧核酸酶5.异丙醇6.乙醇7.磷酸盐缓冲液8.紫外可见分光光度计实验步骤步骤一：准备工作1.将肝脏组织样本切碎，并加入细胞裂解缓冲液中，使细胞释放出DNA。

2.使用均匀器均匀搅拌细胞裂解液，使细胞裂解更加完全。

步骤二：蛋白酶K消化1.在细胞裂解液中加入适量的蛋白酶K，以消化蛋白质。

将细胞裂解液在37°C下孵育1小时，使蛋白质得到降解。

步骤三：脱氧核酸酶处理1.加入适量的脱氧核酸酶，使DNA得到降解，以去除RNA的污染。

2.在细胞裂解液中加入等体积的异丙醇，混匀并离心以沉淀DNA。

步骤四：沉淀DNA1.将离心后的上清液弃置，保留DNA沉淀。

2.加入70%的乙醇，洗涤DNA沉淀。

3.使用离心机离心，将DNA沉淀沉淀下来。

步骤五：溶解DNA1.弃去乙醇，并用磷酸盐缓冲液溶解DNA沉淀。

2.使用紫外可见分光光度计测量DNA的浓度和纯度。

实验结果通过测量，我们得到了肝脏组织中提取到的DNA的浓度和纯度。

根据实验结果，我们可以进一步分析肝脏的遗传信息，从而探究肝脏功能和疾病的相关性。

结论通过本实验，我们成功地提取了肝脏组织中的DNA，并得到了其浓度和纯度。

这为进一步的研究提供了基础，有助于深入理解肝脏的遗传信息和其与疾病之间的关系。

此外，我们的实验方法还可以应用于其他组织的DNA提取，有助于开展更广泛的遗传研究。

动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸DNA,为英文Deoxyribonucleic acid的缩写,又称去氧核糖核酸,是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分,同时也是组成基因的材料;有时也被称为“遗传微粒”,原因是在繁殖过程中,父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中,从而完成性状的传播;DNA是高分子聚合物,DNA溶液为高分子溶液,具有很高的粘度,可被甲基绿染成绿色;DNA对紫外线260nm有吸收作用,利用这一特性,可以对DNA进行含量测定;当核酸变性时,吸光度升高,称为增色效应；当变性核酸重新复性时,吸光度又会恢复到原来的水平;较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性,即DNA双链碱基间的氢键断裂,双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋;在细胞内,DNA能与蛋白质结合形成染色体,整组染色体则统称为染色体组;对于人类而言,正常的体细中含有46条染色体;染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制,细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA 合成后期;对于真核生物,如动物、植物及真菌而言,染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物,如细菌而言,则主要存在于细胞质中的拟核内;染色体上的染色质蛋白,如组织蛋白,能够将DNA进行组织并压缩,以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用,进而调节基因的转录;脱氧核糖核酸的结构DNA的结构： DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平;DNA是一种长链聚合物,组成单位为四种脱氧核苷酸,即腺嘌呤脱氧核苷酸dAMP脱氧腺苷、胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTMP 脱氧胸苷、胞嘧啶脱氧核苷酸dCMP 脱氧胞苷、鸟嘌呤脱氧核苷酸dGMP 脱氧鸟苷;而脱氧核糖五碳糖与磷酸分子借由酯键相连,组成其长链骨架,排列在外侧,四种碱基排列在内侧;每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连,这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列,可组成遗传密码,指导蛋白质的合成;读取密码的过程称为转录,是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA信使RNA的核酸分子;DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’, 5’-磷酸二酯键相连构成的长链;大多数DNA含有两条这样的长链,也有的DNA为单链,如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等;DNA有环形DNA和链状DNA之分;在某些类型的DNA中,5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶,其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富;在某些噬菌体中,5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶;40年代后期,查加夫发现不同物种DNA的碱基组成不同,但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数A=T,鸟嘌呤数等于胞嘧啶数G=C,因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和,一般用几个层次描绘DNA的结构;浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白DNP/RNP的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在 M的盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来;将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出;肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成,肝细胞极小,肉眼看不到,必须通过显微镜才能看到;人肝约有25亿个肝细胞,5000个肝细胞组成一个肝小叶,因此人肝的肝小叶总数约有50万个;肝细胞为多角形,直径约为20-30/加微米,有6-8个面,不同的生理条件下大小有差异,如饥饿时肝细胞体积变大;每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种;肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成;二、实验目的1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白DNP/RNP的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在 M的盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来;将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出;四、实验器材和材料试剂实验器材：①匀浆器②量筒③离心机④离心管⑤试管⑥吸管⑦恒温水浴锅实验材料：①猪肝实验试剂：①L L 柠檬酸钠溶液②95%乙醇.③NaCl固体.④5%SDS溶液5g SDS 定容至100ml⑤V氯仿：V异戊醇20：1的混合液五、实验操作1.称量①称取一定质量的猪肝,加入2倍肝重的L L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎已完成;2.提取DNA①量取肝糜4 ml 于10毫升离心管,在4000r/min下离心10min ,沉淀中再加入8 ml缓冲液于4000r/min离心5 min；②弃上清,取沉淀；③将沉淀用10 ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入5 ml 氯仿-异戊醇混合液、1 ml SDS,振荡30min保鲜膜封口；④缓慢加入固体NaCl约,使其最终浓度为1mol/L；⑤将溶液分装到2个10毫升离心管中,在4000r/min离心5 min,取上清水相；⑥在上述水相溶液中分别加等体积冷95%乙醇,边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动,将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇,即得DNA粗品；⑦用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中;3.标准曲线的绘制按下表加入各种试剂,混匀,于60℃恒温水浴锅45min,冷却后,在595nm波长下于分光光度计比色测定,以吸光度对DNA浓度作图,制作标准曲线;4.样品的测定将DNA粗品定容至25ml容量瓶,再取DNA样液,加入蒸馏水,混匀;然后准确加入二苯胺试剂,混匀,于60℃恒温水浴锅45min,冷却后,595nm波长下于分光光度计比色测定,根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量ug;5.计算100g猪肝中DNA含量w=m1/m2×100%w：DNA的质量分数%m1：样液中测得的DNA的质量ugm2：样液中所含样品的质量ug六、实验数据处理1.标准曲线2.实验结果处理猪肝质量为DNA提取液体积为根据公式w=m1/m2×100%得：w=％则100g猪肝中DNA含量为：w×100=七、思考题1.实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用答：①柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂,也是pH缓冲溶液；②SDS是表面活性剂,可以让蛋白质与DNA分开；③氯仿是有机溶剂,可以使蛋白质聚集沉淀,便于分离出去；④异戊醇是消泡剂,可以减少泡沫的发生；⑤氯仿-异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解；⑥NaCl固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液,在这样的环境中DNA核蛋白能溶解,RNA核蛋白则溶解度很低,可以利用这一性质分离两种核酸;八、实验注意事项主要集中在细胞核中,因此,通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备DNA的材料,小牛胸腺组织中细胞核比例较大,因而DNA含量丰富,同时其脱氧核苷酸酶活性较低,制备过程中DNA被降解的可能性相对较低,所以是制备DNA的良好材料,但其来源较困难,脾脏或肝脏易获得,也是实验室制备DNA常用的材料,本实验用新鲜肝脏作为实验材料;2.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解,须采取以下措施：整个过程必须在低温下进行,可加入某些物质抑制核酸酶的活性,如柠檬酸钠、EDTA、SDS等,EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂;3.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多,经常采用的有：氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等,他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚,并释放出核酸;4.使用离心机时,对称放置的离心管必须用天平调平衡;5.避免剧烈振荡,如研磨过程、搅拌过程等;九、实验结果误差分析及讨论经过对本次实验结果进行分析,得出100g猪肝中DNA含量大约为的结论,在上网查阅相关资料后发现：猪肝中DNA含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合;由此可知,本次试验结果是相对比较成功的,较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术,基本达到了本次实验的目的;但是本次实验结果只是粗略测量,并未达到精确测量猪肝中DNA的含量,且实验数据较理论值偏低,这是由于某些误差导致,在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差,经分析得出以下几点：①在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中,由于猪肝组织表面较滑不易磨碎,且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留,因此可能导致猪肝中DNA 提取不充分,致使实验数据较理论值偏低；②研磨过程中,可能由于操作不当,导致部分液体溅出,因此可能使得提取液中部分DNA损失,导致实验数据偏低；③在粗提取DNA操作中,频繁地将DNA提取液转移至各个仪器内,可能有极小部分DNA提取液未倒净,残留在仪器壁上损耗掉,导致实验误差；④在使用移液枪的过程中,可能因为操作不当或移液枪经常错误使用,出现仪器误差,导致吸取的DNA样液不精确,出现实验误差；⑤在水相中加入乙醇析出DNA时,不是所有DNA均析出,有小部分依旧融在溶液,导致提取出的DNA含量偏低；⑥标准曲线制作过程中出现些许误差；总的来讲,本次试验结果是相对比较成功的,较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术,基本达到了本次实验的目的;在今后的实验中会着重注意实验操作的严谨性,严格按照实验前拟定完全的实验步骤进行,保证将实验操作过程中可能出现的误差概率降到最低,尽可能达到预期的实验效果,完成自我的学习及锻炼过程;。

一、实验目的1. 学习并掌握肝脏组织提取的原理和步骤。

2. 熟悉肝脏组织提取过程中所需的仪器和试剂。

3. 掌握肝脏组织提取过程中注意事项，提高实验操作技能。

二、实验原理肝脏组织提取实验主要是通过一系列的物理和化学方法，将肝脏组织中的细胞、细胞器、蛋白质、核酸等生物大分子分离出来，以便于后续的生物学研究。

本实验采用匀浆法提取肝脏组织，通过裂解细胞、离心、洗涤等步骤，获得较为纯净的肝脏组织。

三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜小鼠肝脏组织2. 试剂：TRIzol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水、RPMI 1640培养基等3. 仪器：匀浆器、高速离心机、移液器、离心管、玻璃匀浆器、EP管等四、实验步骤1. 匀浆处理：将新鲜小鼠肝脏组织在玻璃匀浆器中磨碎，每50到100mg组织加入1ml TRIzol试剂，用匀浆器进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol试剂体积的10%。

2. 室温放置：将匀浆器样品在室温放置5分钟。

3. 振荡混合：每使用1ml TRIzol试剂加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

4. 离心分离：2到8 10000Xg离心五分钟，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中。

5. 转移水相：将水相转移到新管中。

6. 沉淀RNA：每使用1ml TRIzol试剂加入0.5ml异丙醇，室温放置1分钟。

7. 离心分离：2到8 10000Xg离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

移去上清。

8. 洗涤RNA：用75%乙醇洗涤RNA沉淀，每使用1ml TRIzol试剂至少加入1ml 75%乙醇，2到8 8000转离心5分钟，弃上清。

9. 干燥RNA：室温放置干燥RNA沉淀，大约晾5到10分钟即可。

10. 溶解RNA：加入25微升无RNase的DEPC水，用枪头吸打几次，放置10分钟使RNA溶解。

11. 保存RNA：-20℃保存。

实验四肝组织中核酸的提取和鉴定一、实验目的：1.了解核酸提取的主要原理和方法。

2.掌握核酸提取实验操作技能。

3.掌握核酸鉴定实验操作技能。

二、实验原理：核酸提取是生物学中的常用操作，其中DNA 和 RNA 分别用于分子生物学和生物信息学研究中。

肝作为重要的代谢器官，其中含有大量的核酸。

肝组织中核酸的提取主要步骤包括细胞破碎、蛋白质去除、核酸溶解和纯化等。

随着生物技术的不断发展，目前常用的核酸提取方法主要包括酚-氯仿法、CTAB 法、盐法等。

本实验将采用CTAB 法提取肝组织中的总核酸。

酚-氯仿法：酚和氯仿在一般情况下是不混溶的，但当二者混合时，由于酚的分子大小和分子内极性变化，使酚分子具有两种不同的极性，可以在解理体系中表现出较强的亲和性，因此酚能沉淀核酸和蛋白质复合物，而使DNA、RNA清洗得更纯。

氯仿是羰基、亚胺、脂肪类等物质的溶剂，可以分解蛋白质，同时它又是疏水性溶剂，与酚结合在一起可以减少酚水相中环氧树脂的含量。

CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型的表面活性剂，由于其可与核酸形成稳定的复合物，在NaCl的介质中能选择性分离出核酸。

CTAB 的选择性可以用于除去单细胞内存在的大量DNA。

(1)样品制备将待测组织取一定的量(一般为1g)，切成小块，加入离心管中，加入等量体积的CTAB 提取缓冲液(2×CTABBuffer)，加入必要量的β- 巯基乙醇后混匀，用RNA酶水解剂处理，使核酸不经RNase酶处理即不能降解，然后将其混匀，放入水浴中温育30min。

温育完后，加入一定量的氯仿和异戊醇，混匀后离心。

在上层水相与下层有机相之间，出现一层白色的粘稠界面，界面中夹杂有蛋白质和DNA。

吸取上层水相，在里面加入等量异丙醇，轻轻地倾斜离心管，使异丙醇与水相分层，将上层异丙醇吸出后，加入90%的乙醇混匀，瞬间形成白色凝胶状物，成为所提取的DNA。

将其用75%酒精洗涤数次，直至酒精中没有崩解压缩改变形状的物质，使其干燥。