嗜血杆菌分离与鉴定过程讲解

副猪嗜血杆菌病病原菌的分离与鉴定概述：副嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)引起的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为革拉泽氏病(Glasser’SDisease)，影响从2周龄到4月龄的青年，主要在断奶前后和保育阶段发病。

通常见于5～8周龄的，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达到50％。

主要临床症状表现为咳嗽，呼吸困难，消瘦，跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为胸膜炎，心包炎，腹膜炎，关节炎和脑膜炎等。

随着世界养业的发展，该病已成为全球范围内影响养业的典型细菌性疾病。

由于饲养技术的调整以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。

近年来，随着水平的提高，副嗜血杆菌在我国各场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，其损失相当惨重。

为预防该病，国内外虽然研制了各种类型的基因工程菌苗与多价灭活菌苗，但由于副嗜血杆菌血清型众多，各个地方的流行菌株各不相同，各个血清型之间的交叉保护性不高，菌苗的免疫效果并不理想。

笔者对长治市某大型场的副嗜血杆菌进行了分离和鉴定，以便选择针对性较强的菌株作为菌苗株，以起到更好的预防效果，并为副嗜血杆菌病的进一步研究奠定基础。

1材料与方法1．1病料的采集对2个病死仔进行尸体解剖(应无菌操作)，打开胸腔和腹腔，首先吸取积液或以棉签拭取胸膜及腹膜粘附物，然后再取内脏，内脏器官须实验室无菌操作，以灼烧过的手术刀烫烙剖面，取深层组织涂板培养。

1．2主要培养基本试验选择以下配方：胰蛋白胨0．6g、酵母浸出粉1．0g、可溶性淀粉0．25g、枸椽酸钠0．15g、普通营养琼脂粉4．5g。

加蒸馏水至lOOmL，溶解后调pH至7．2～7．4，然后高压上述混合物，120％，15min。

在水浴中冷却至80％。

加10mL无菌脱纤绵羊血，在80％水浴中漩摇10～15min。

在冷却至50％时，加入无菌辅酶I(NAD)至15g／mL，加入万古霉素至50g／mL。

倾倒大约4mm厚平皿，冷却后4℃保存备用。

微生物检验实验室嗜血杆菌属检验标准操作规程1. 概述嗜血杆菌属包括流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、杜克嗜血杆菌等9个种。

临床上以流感嗜血杆菌最为常见。

2. 标本类型血液、痰、脑脊液标本。

3.鉴定3.1 形态与染色革兰阴性短杆菌。

3.2 培养特性在巧克力琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成微小、无色透明似露滴状的菌落。

在血琼脂平板上形成极小、圆形、透明的菌落，并有“卫星现象”。

3.3 生化反应分解葡萄糖，不分解蔗糖和乳糖，吲哚、触酶和硝酸盐还原试验均为阳性。

3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，多形性，菌落为无色透明似露滴状，卫星现象阳性，生长需要X、V两种因子，普通培养基不生长。

3.4.2 流感嗜血杆菌的种间鉴别见表嗜血杆菌鉴别的关键性试验-++-++-++ 注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11-89%菌株阳性，“W”为弱发酵反应。

3.5 操作步骤3.5.1 涂片、革兰染色呈革兰阴性短小杆菌。

3.5.2 鉴定从巧克力琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。

4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。

5.质量控制见《质量管理程序》。

6.检验结果解释与分析如果检出β-内酰胺酶阳性流感嗜血杆菌则提示对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药（耐药机制大多为TEM型β-内酰胺酶）。

如果流感嗜血杆菌β-内酰胺酶阴性，而对氨苄西林耐药，则对阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢克罗、头孢他啶、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛均耐药。

7.临床意义流感嗜血杆菌常寄居于正常人呼吸道（在呼吸道定植者可达到人群的50%），当机体抵抗力下降时，可引起人类呼吸道感染；也也可随血液入侵组织内部，引起脑膜炎、关节脓肿或其他部位的化脓感染。

副流感嗜血杆菌寄居在人类的上呼吸道，可引起呼吸道感染，偶尔引起心内膜炎等。

鸡副嗜血杆菌的分离与鉴定摘要：鸡副嗜血杆菌可以引起鸡传染性鼻炎（IC），以鼻炎和鼻窦发炎、结膜炎、流鼻涕、打喷嚏、面部肿胀为主要症状。

对养禽业带来重大的经济损失。

本文根据细菌的分离培养、形态观察、血凝试验、易感动物回归试验及PCR鉴定对副嗜血杆菌进行分离与鉴定。

关键词：鸡副嗜血杆菌、分离、鉴定自20世纪80年代以来，许多国家和地区均有爆发鸡副嗜血杆菌病的报道，且近期鸡副嗜血杆菌的发生率呈上升趋势，它是集约化养鸡场中重要的疫病之一。

鸡副嗜血杆菌可以引起鸡传染性鼻炎（IC），以鼻炎和鼻窦发炎、结膜炎、流鼻涕、打喷嚏、面部肿胀为主要症状。

本病多见于雏鸡群和产蛋鸡群，造成淘汰鸡数显著增加以及产蛋率显著下降，同时易引起流感或新城疫的并发，造成鸡场的重大经济损失。

副鸡嗜血杆菌 (Haemophilusparagallinamm，Hpg)是一种引起鸡急性上呼吸道疾病的致病菌。

该呼吸道疾病俗称鸡传染性鼻炎 (Infectiouscoryza，IC)，临床上以面部水肿、鼻窦炎、流泪为主要特征，可引起产蛋鸡的产蛋量下降，育成鸡的生长受阻、开产期推迟，肉鸡增重下降，给养禽业造成巨大的经济损失[1,2]。

1920年，Beach首次对鸡传染性鼻炎进行了报道。

1931年，DeBlieck成功分离了病原。

自20世纪 80年代以来，在我国河北、北京、云南、山东、湖北等省市先后爆发鸡传染性鼻炎。

冯文达于 1987年首先在北京分离到 1株细菌，证实了副鸡嗜血杆菌在我国的广泛存在[3]。

按照 Page的分型方法，通过平板凝集试验可将副鸡嗜血杆菌分为 A、B和 C3个血清型[4]。

乔朋波[5]研究表明不同血清型的副鸡嗜血杆菌在生长特性、致病性、药物敏感性和外膜蛋白结构等方面均存在差异。

目前，在我国副鸡嗜血杆菌以 A型和 C型菌株的流行为主，部分地区己经有 B型株的存在[6]。

流行于我国的不同血清型副鸡嗜血杆菌的先后有分离与鉴定的报道。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制引言：副猪嗜血杆菌（Actinobacillus suis），属于革兰阴性菌，是猪猩红热的病原菌，可引起猪的败血症、关节炎等严重疾病，对养殖业造成了严重威胁。

因此，对副猪嗜血杆菌进行准确分离鉴定，并研制出有效的疫苗，对于疾病的控制和预防起着重要作用。

一、副猪嗜血杆菌的分离鉴定方法1. 采集样品：从病猪关节、心脏等部位采集组织样品，并迅速送至实验室进行处理。

2. 消毒处理：将采集到的样品进行外部消毒处理，避免其他细菌的污染。

3. 细菌分离：将样品切成小块，接种于选择性培养基（专门用于分离培养副猪嗜血杆菌的培养基），并在适宜条件下培养。

4. 菌体特征观察：观察分离培养物的菌落形态、颜色等特征，以初步判断其为副猪嗜血杆菌。

5. 生化试验：通过一系列碳源利用试验、酶活性测试等进行进一步鉴定，以确认其为副猪嗜血杆菌。

6. 分子生物学鉴定：采用PCR技术，利用特异性引物扩增副猪嗜血杆菌的特异基因片段，通过比对序列与已知菌株的基因序列进行比对，确认其为副猪嗜血杆菌。

二、副猪嗜血杆菌菌体灭活苗的研制1. 菌体培养：在含有适宜营养成分的培养基中培养副猪嗜血杆菌，并控制培养条件，使细菌倍增到一定浓度。

2. 菌体灭活：通过加热、紫外线照射、化学消毒等方法对菌体进行灭活，同时保持菌体表面抗原的完整性。

3. 佐剂的选择：选择合适的佐剂，如低聚糖、脂质体等，以增强疫苗的免疫效果。

4. 疫苗制备：将菌体灭活液与佐剂充分混合，并进行过滤、冷冻保存等步骤，得到最终的菌体灭活苗。

5. 动物实验证实：选择一定数量的健康猪作为实验对象，将灭活苗进行注射，观察其免疫效果、安全性等指标，并与对照组进行对比分析。

6. 疫苗生产：在动物实验证实通过后，将菌体灭活苗进行大规模生产，以满足养殖业的需求。

三、疫苗的应用与前景展望副猪嗜血杆菌菌体灭活苗的研制成功，为猪猩红热的防控提供了重要工具。