大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案

1.3.2细菌的生化鉴定挑取可疑菌落纯培养物，分别接种于蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、卫矛醇、乳糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、鼠李糖、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸柠檬酸钠、乳糖胆盐、M.R 试验、靛基质、侧金盏花醇、肌醇、水杨苷、尿素、明胶、半固体及H2S培养基中37 ℃培养24～48 h。

1.3.3致病力试验将分离到的细菌接种普通肉汤培养基，37℃培养24h。

选择日龄、体重、性别、精神状态相似的小白鼠12只，分为三组。

第一组与接种所分离到的大肠杆菌，每只腹部皮下接种0.3ml。

第二组接种等同量的肉汤作为对照。

能致小白鼠发病死亡，并从试验小白鼠体内分离细菌，再经生化试验鉴定为性大肠杆菌的菌株用于药敏试验。

1.4药敏试验采用纸片琼脂扩散法（K-B法）。

大肠埃希氏菌菌液浓度标化后15min之内接种于药敏培养基，以无菌棉拭子蘸取已制备好的菌液，并在管壁上拧压除去多余的菌液后，向一个方向均匀涂布接种于M-H琼脂平板表面，然后将平板每转动60度涂布一次，共涂三次，最后沿平板边缘涂布一圈。

盖上平皿盖，置室温干燥3~5min待平皿面稍干后用无菌镊子或纸片分配器将含药纸片平放于含菌琼脂平板表面，并轻压使其紧贴在上面。

纸片应贴得均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板内缘应不少于15mm。

直径为90mm 的平皿可贴6~7张纸片。

纸片贴牢后避免再次移动，因为有些药物立刻就可扩散于琼脂内。

平板经室温放置15min再倒置于35℃培养箱中，培养16~18h后阅读结果。

1.5防治措施对猪舍进行全面的消毒；病猪硫酸卡那霉素等敏感药物进行治疗对与病弱的仔猪进行补液、强心等支持疗法；对与临床水肿症状明显的猪进行消肿利尿、镇静等治疗。

对病猪使用以下处方：卡那霉素(25万单位／毫升)2毫升、5％碳酸氢钠30毫升、25％葡萄糖液40毫升，混合后1次静注，每日2次；同时肌肉注射维生素C(0.l克)2毫升，每日2次。

2.试验结果2.1病原菌的分离培养与鉴定结果2.1.1菌落形态与涂片、染色、镜检结果普通琼脂平板上形成圆形、隆起、边缘整齐、湿润、中等大小、灰白色的半透明菌落。

致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验1.材料与方法1.1实验材料1.1.1器材设备：剪刀、镊子、手术刀、接种环、接种针、涂布棒、酒精灯、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、革兰氏染液、光学显微镜、香柏油、恒温培养箱、游标卡尺等。

1.1.2病料采集：根据临床症状、流行病学采集疑似发病未死猪或刚死亡猪只的肝脏、脾脏、心脏、肺脏、大肠、排泄物等并冷藏运输于3h内送至实验室，待检。

1.1.3培养基与试剂：普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、微量生化反应管、药敏片、青霉素等抗生素。

1.2试验方法1.2.1细菌的形态学检查：触片镜检，用镊子夹取待检病料一端，再用灭菌过的剪刀剪出一个切面，将新鲜的切面在干净的载玻片上轻触几下，载玻片自然干燥后进行瑞氏染色或美兰染色并镜检。

可初步判断待检病料中是否含有细菌。

触片也可以是排泄物悬浮液或研磨后的组织液，注意，为避免细胞碎片影响观察，涂片或触片时一定要均匀、薄。

1.2.2分离培养：将手术刀灼烧趁热在待检病料表面烫一下，以杀灭其表面杂菌；用无菌剪刀在烫面剪出一个小口，用灭菌过的接种环从其切面伸入并旋转勾取组织，用分区划线的方法接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上；或将组织研磨后用灭菌生理盐水或灭菌PBS液稀释，再用接种环勾取悬浮液使用分区划线的方法接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上，置37℃恒温箱培养18-24h后观察菌落形态。

在普通营养琼脂培养基上长出灰白色光滑圆形菌落，麦康凯培养基上长出粉红色或砖红色光滑圆形菌落，在伊红美蓝培养基上长出紫黑色并有金属光泽的光滑圆形菌落。

注：麦康凯培养基和伊红美蓝培养基为鉴别培养基。

1.2.3培养物革兰氏染色：用接种环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上→用接种环挑去麦康凯培养基上单个中等大小的红色菌落于生理盐水中混匀→均匀涂布成直径约为1cm的薄层→那载玻片在酒精灯上方30-40cm处干燥→使用酒精灯外焰固定→滴加一滴草酸结晶紫1min→水洗→加革兰氏碘液2-3min→水洗→95%酒精脱色0.5-1min →水洗→滴加石炭酸复红0.5-1min，用滤纸吸干，油镜镜检。

鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。

1 病料采集1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。

1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。

1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。

将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。

都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。

将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。

2 菌的分离培养及鉴定2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。

培养基：A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1），B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。

），C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。

2．2 样品触片镜检涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。

2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。

2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。

一例孔雀大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验分析一、研究目的本实验的目的是对孔雀大肠杆菌进行分离鉴定及药敏试验分析，了解其生物学性质和药敏性，为临床治疗提供参考。

二、实验方法1. 样品的采集和处理在清洁的实验室中，取任一新鲜粪便标本，将其处理为10%悬液。

然后，取1ml悬液加入到含有2mlLB液体培养基的试管中，在37℃下培养24小时以促进菌落的生长。

2. 细菌分离与筛选将培养基中的菌液分别接种在Eosin Methylene Blue (EMB)、MacConkey(MAC)和血液琼脂平板上，分别平板法和液体培养法选择合适的菌落对于筛选孔雀大肠杆菌，并在含有2mlLB液体培养基的试管中进行黑色素形成试验。

3. 生理与生化鉴别分别进行革兰染色、杨氏染色和氧化酶试验。

根据气、解葡萄糖，老化反应等特点鉴定细菌。

4. 药敏试验选取10种常用抗生素，在含有不同抗生素的培养基中培养菌量，观察菌落的生长情况，并进行药敏测定。

三、实验结果1. 菌落形态Eosin Methylene Blue (EMB) 筛选出E.coli的黑色素、MacConkey(MAC)筛选出E.coli 的菌落、血液琼脂扩散法筛选出孔雀大肠杆菌，孔雀大肠杆菌的菌落形态呈灰色或者白色，并且在血液琼脂平板中可以观察到透明区导致血红蛋白分解，形成绿色，这是孔雀大肠杆菌的特征。

2. 细菌形态和结构通过杨氏染色和革兰染色观察到孔雀大肠杆菌是革兰阴性菌。

根据常规生化试验，孔雀大肠杆菌乳糖发酵试验Wei酸消化试验等，可以鉴定出孔雀大肠杆菌的生理和生化特征。

孔雀大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、头孢第二代，第三代和第四代和四环素等药物表现出不同程度的抵抗力。

本实验采用了不同的方法对孔雀大肠杆菌进行了分离鉴定及药敏试验分析。

根据实验结果，孔雀大肠杆菌菌落呈灰色或者白色，在血液琼脂平板中观察到绿色透明区，杨氏染色渗出部位呈现白色透明沉淀，革兰染色呈现灰色或偏红色。

药敏试验结果显示孔雀大肠杆菌对于氨苄西林和四环素等药物表现抗药，对于第四代头孢菌素和亚胺培南等药物表现出较强的敏感性。

一例孔雀大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验分析
1. 样品的采集与处理
首先，我们从一组被怀疑感染孔雀大肠杆菌的患者中采集肛门拭子样本，并送往实验室。

样本的处理过程应在48小时内完成。

样本送达实验室后，我们进行了样品预处理。

首先，将样品加入到10毫升的肉汤培养基中，并在37℃常温下培养24小时，以促进微生物的增殖。

3. 大肠杆菌的筛选及分类鉴定
然后，我们对培养基中的菌落进行筛选并分类鉴定。

我们用营养琼脂培养基对菌落进行了简单的筛选。

筛选出的菌落通过瑞氏染色法进行分类鉴定。

孔雀大肠杆菌的鉴定需要通过生化试验进一步验证。

我们进行了以下的试验。

1）氧化酶试验
2）革兰氏染色试验
3）三糖发酵试验
4）甲醛耐受试验
5）INP测试
分析上述试验的结果，我们确认了分离出的细菌为孔雀大肠杆菌。

5. 药敏试验
对孔雀大肠杆菌进行药敏试验，我们采用了纸片扩散法。

我们测试了26种不同的抗生素对孔雀大肠杆菌的抗菌性。

结果显示，其中12种抗生素对孔雀大肠杆菌具有抑制作用。

这些抗生素包括氨苄西林、头孢曲松、环丙沙星等。

在本实验中，我们成功地分离鉴定出了孔雀大肠杆菌，并进行了药敏试验分析。

该实验为我们探究该细菌的抗性提供了重要的实验数据。

一例孔雀大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验分析一、实验目的：了解孔雀大肠杆菌的分离、鉴定及药敏试验方法，掌握细菌学的实验技能。

二、实验原理：1、孔雀大肠杆菌是一种强致病性的肠道病原菌，引起各种疾病。

2、分离方法：运用细菌学的分离技术，将样品经过适当的处理后，接种到含有适宜培养基的培养皿中，并能够选择性地分离出孔雀大肠杆菌。

3、鉴定方法：定义特定的生化特征，使得与该菌密切相关的物质也能够被检测到。

常用的鉴定方法包括酸生产、气体生成、蛋白分解等。

4、药敏试验方法：通过对孔雀大肠杆菌进行不同的药物敏感性试验，以便筛选出最佳的治疗方案。

三、实验步骤：1、样品采集：采集饮食、水源、分泌物等样品。

2、分离培养：将样品处理后接种到营养琼脂平板中，放置于37℃的孵育箱中；24小时后，嫩白色的菌落将出现在琼脂平板表面。

3、鉴定：取少量细菌放到琼脂饼中，利用酸生产，气体产生、蛋白分解等反应进行鉴定。

4、药敏试验：对孔雀大肠杆菌进行药物敏感性试验，以便找出最佳的治疗方案。

四、实验结果：1、分离结果：样品中分离出嫩白色的菌落，证实样品中含有孔雀大肠杆菌。

2、鉴定结果：样品中分离出孔雀大肠杆菌，并通过酸生产、气体产生、蛋白分解等方法鉴定出该菌种。

3、药敏试验结果：孔雀大肠杆菌对盐酸多西环素、甲硝唑、磺胺、氨苄西林等抗菌药物敏感，对青霉素、环丙沙星、庆大霉素等药物耐药。

五、实验分析：1、该实验成功地分离出了样品中的孔雀大肠杆菌。

2、孔雀大肠杆菌对某些抗菌药物具有耐药性，药敏试验结果提示其对青霉素、环丙沙星及庆大霉素等药物比较耐药，建议在治疗过程中避免使用这些药物。

3、用于孔雀大肠杆菌药敏试验前，药物浓度、孔径的选取要科学合理，保证药敏试验结果的准确性和可靠性。

六、注意事项：1、在实验中操作要细心、仔细，注意个人防护。

2、所有培养皿要完好无损，无裂缝、污染和漏洞。

3、样品处理要完全避免菌落的污染，以免影响实验结果。

4、在实验过程中要遵守消毒等规定，保持操作区域的整洁干净。

鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏实验随着养鸡业集约化、产业化的不断发展，疾病越来越多，细菌对抗生素的耐药性越来越强，在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，需要选择对致病菌比较敏感的药物来进行预防和治疗，达到有效控制疾病的目的。

为了控制鸡大肠杆菌在鸡群中的传播，我们对送检的疑似大肠杆菌病例进行病原的分离鉴定，并对分离菌的培养特性、致病力及抗菌药物的敏感性进行了研究，为有效防制鸡大肠杆菌病提供了依据。

关键词：大肠杆茵；分离鉴定；药敏1 材料1.1病料来源采自鸡场150～200日龄有典型气囊炎、肝包膜炎、心包膜炎和败血症的病死蛋鸡的肝脏、脾脏、心血等。

1.2 培养基普通琼脂培养基与普通肉汤培养基[LB培养基：固体：胰蛋白胨1.0g加入酵母提取物0.5g、NaCl0.5g，、琼脂粉1.5g使其充分溶解，高压灭菌20min，铺板并保存于4℃”。

液体：胰蛋白胨1.0g加入0.5g酵母提取物、0.5g NaCl，然后定容至100ml，高压灭菌20min，4℃保存]麦康凯琼脂培养基水解酪蛋白（MH）培养基三糖铁琼脂（蛋白胨20g，牛肉浸膏5g，乳糖10g，蔗糖10g，葡萄糖1g，NaCL5g，硫代硫酸钠0.2g，硫酸亚铁0.2g，琼脂粉20g，加热溶解后PH调至7.4加入0.4%酚红水溶液6.3ml蒸馏水定容1000ml，分装4-5ml灭菌，制成底层较深的斜面）胰蛋白胨水溶液（蛋白胨2.5g，NaCL 1.25g，蒸馏水250ml，PH调至7.6，分装灭菌）葡萄糖蛋白胨水溶液（100mlpH7.6的邓亨氏蛋白胨水中加葡萄糖1g，溶解后分装1ml 每管，灭菌）1.3 仪器与器材超净工作台，天平、接种环，平皿，试管，灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、离心机、细菌微量生化反应器、pH计、旋涡混合振荡器96孔板、灭菌试管、容量瓶、刻度吸管、接种环、移液器和吸头等生化发酵管（葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、尿素分解管、硫化氢、枸橼酸盐、赖氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、半固体琼脂、蛋白胨水、木糖、葡萄糖磷酸盐、山梨醇等）1.4 药物与试剂琼脂，肉汤，麦康凯琼脂，95%酒精、甲基红、α萘酚酒精、氢氧化钾、结晶紫、草酸铵、碘化钾、碘片、复红、MH肉汤、MH琼脂M-R试剂（用95%酒精60ml溶解0.02g甲基红，定容100ml）V-P试剂（甲：5%α萘酚酒精溶液；乙：40%氢氧化钾水溶液，装于棕色瓶，4℃保存）草酸铵结晶紫染液（A液：结晶紫2g研细后加入95%酒精20ml使之溶解；B液：草酸铵1g溶于100ml蒸馏水，两液混合）革兰氏碘液（2g碘化钾溶解于少量水中，加入1g碘片使之完全溶解，定容300ml）复红染液（2.5ml复红加100ml酒精，取混合液10ml加80ml蒸馏水）2. 大肠杆菌的分离鉴定2.1大肠杆菌的分离培养无菌采集病、死鸡的肝脏、心血等组织，划线接种于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板及普通肉汤，37℃培养18～24h，挑取可疑菌落接种在麦康凯琼脂平板/普通琼脂上，37℃培养18～24 h；再挑取粉红色单个菌落再接种在麦康凯琼脂平板/普通琼脂上分区划线，37℃培养18～24h。