大肠杆菌的分离鉴定

一、实验目的1. 了解大肠杆菌的生物学特性。

2. 掌握大肠杆菌的分离、纯化和鉴定方法。

3. 掌握大肠杆菌的培养和计数方法。

二、实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是肠杆菌科的一种细菌，广泛存在于人体肠道中。

本实验通过分离、纯化和鉴定大肠杆菌，了解其生物学特性，并掌握其培养和计数方法。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜粪便、营养琼脂平板、营养肉汤、无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、无菌培养皿、无菌移液器、酒精灯、显微镜等。

2. 实验仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、无菌操作台等。

四、实验方法1. 大肠杆菌的分离（1）取新鲜粪便样品，用无菌生理盐水进行稀释。

（2）取适量稀释液，用无菌棉签涂布于营养琼脂平板上。

（3）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。

2. 大肠杆菌的纯化（1）观察平板上的菌落，挑选单菌落，用无菌移液器移至新的营养琼脂平板上。

（2）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。

3. 大肠杆菌的鉴定（1）观察纯化后的菌落，记录菌落特征，如大小、形状、颜色等。

（2）将纯化后的菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。

（3）取培养液，用显微镜观察细菌形态，并进行革兰氏染色。

（4）对培养液进行生化试验，如乳糖发酵试验、吲哚试验等。

4. 大肠杆菌的培养与计数（1）将纯化后的菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。

（2）用无菌移液器取适量培养液，进行系列稀释。

（3）取稀释液，涂布于营养琼脂平板上。

（4）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。

（5）观察平板上的菌落，记录菌落数，并计算大肠杆菌的浓度。

五、实验结果与分析1. 大肠杆菌的分离：在平板上观察到圆形、光滑、白色、半透明的菌落，说明已分离出大肠杆菌。

2. 大肠杆菌的纯化：经过纯化后，菌落特征与分离菌落相同，证明已得到纯化的大肠杆菌。

3. 大肠杆菌的鉴定：通过显微镜观察，发现细菌为革兰氏阴性短杆菌，生化试验结果显示该菌株能发酵乳糖，产生吲哚，表明已鉴定为大肠杆菌。

分离鉴定粪便中的大肠杆菌的实验流程鉴定粪便中的大肠杆菌是一项十分重要的实验，它可以帮助我们评估肠道健康状况，检测是否存在致病性大肠杆菌的感染，对于疾病的防控具有重要意义。

下面，我将详细介绍一下分离鉴定粪便中的大肠杆菌的实验流程。

我们需要准备实验所需的材料和试剂。

材料包括培养皿、接种环、培养基等，而试剂包括洗涤剂、生理盐水、大肠杆菌特异性培养基等。

在实验开始前，我们需要确保实验器具和培养基无菌，并且消毒实验台面和使用的工具，以避免外界微生物的干扰。

我们需要进行样品的处理和制备。

取一定量的粪便样品，并将其进行振荡或均匀搅拌，使其中的微生物均匀分布。

我们将取一小部分样品进行稀释，目的是为了在培养皿上获得适当的菌落数，方便观察和鉴定。

接着，我们把经稀释处理后的样品加入到培养基中，使细菌能够在适宜的温度下进行培养。

大肠杆菌通常在37摄氏度下培养，因此我们需要将培养皿放入恒温箱中，在一定的时间后进行观察。

在培养的过程中，我们需要定期检查培养皿的状态，观察是否有典型的大肠杆菌形态的菌落出现。

除了观察菌落形态之外，我们还可以利用生化试剂进行鉴定。

通过添加特定的生化试剂，如甲酚红葡萄糖琼脂培养基、大肠杆菌的IMViC生化试剂等，可以帮助我们鉴定大肠杆菌。

这些试剂可以根据大肠杆菌的代谢特点，进行色素反应或气体产生反应，从而帮助我们确认目标菌株的身份。

我们需要进行进一步确认。

在鉴定出大肠杆菌后，我们可以利用进化树分析等生物信息学方法，对其遗传特征进行分析，以确保其准确性。

我们还可以进行致病性检测，通过PCR等分子生物学技术检测目标菌株是否携带致病因子，从而评估其致病性。

通过以上的实验流程，我们可以较为准确地分离鉴定粪便中的大肠杆菌。

这项实验的结果将为我们提供重要的信息，有助于评估肠道健康状况，及时发现致病性大肠杆菌的感染，为疾病的预防和控制提供重要依据。

大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案实验原理：1、大肠杆菌的性质：大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。

在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。

三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。

生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。

MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。

半固体中沿穿刺线向四周生长。

2、沙门氏杆菌的性质：沙门氏杆菌是G-直杆菌。

在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。

能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。

实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：（1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。

（2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。

（3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。

三、细菌分离培养：（1）取出培养了24小时的麦康凯平板。

挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。

（2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。

四、细菌的鉴定纯化：（1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。

实验原理：1、大肠杆菌的性质:大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。

在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。

三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。

生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。

MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S,不能利用xx酸盐。

半固体中沿穿刺线向四周生长。

2、沙门氏杆菌的性质：-沙门氏杆菌是G直杆菌。

在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。

能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。

实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：(1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。

(2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。

(3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。

三、细菌分离培养：(1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。

挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。

(2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。

四、细菌的鉴定纯化：(1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。

分离大肠杆菌的方法大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，具有广泛的应用价值。

在科学研究和实际应用中，需要将大肠杆菌与其他细菌分离开来，以便进行进一步的研究和利用。

下面将介绍几种常用的分离大肠杆菌的方法。

1. 革兰氏染色法革兰氏染色是一种常用的细菌分类和鉴定方法，也适用于分离大肠杆菌。

该方法基于细菌细胞壁的染色反应，将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。

大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，通过革兰氏染色可以将其与革兰氏阳性菌区分开来。

2. 培养基选择法大肠杆菌对不同培养基有特定的生长要求，可以利用这一特性进行分离。

常用的培养基有MacConkey培养基和Eosin Methylene Blue (EMB) 培养基。

这两种培养基中都含有特定的抑菌剂，可以抑制大肠杆菌以外的其他细菌的生长，从而使大肠杆菌能够生长并形成特征性的菌落。

3. 双层琼脂糖平板法双层琼脂糖平板法是一种常用的分离大肠杆菌的方法。

该方法利用了大肠杆菌产生气体的特性。

首先，在琼脂糖平板上均匀涂抹待分离样品，然后在上层平板上加上一层液体琼脂糖。

如果样品中存在大肠杆菌，它们会在培养过程中产生气体，使液体琼脂糖上升形成气泡，从而可以观察到特征性的气泡形成。

4. PCR 筛选法PCR 筛选法是一种高效的分离大肠杆菌的方法。

它利用了大肠杆菌特有的基因序列，通过特异性引物扩增目标基因片段，并通过凝胶电泳分离和鉴定。

这种方法具有高灵敏度和高特异性，可以快速、准确地分离大肠杆菌。

总结起来，分离大肠杆菌的方法有革兰氏染色法、培养基选择法、双层琼脂糖平板法和PCR 筛选法等。

在实际应用中，可以根据具体需要选择适合的方法进行分离和鉴定。

这些方法的应用不仅可以帮助科研人员深入了解大肠杆菌的特性和生理功能，还可以为医学诊断、食品安全等领域提供有力的支持。

大肠杆菌的分离鉴定
大肠杆菌是一种重要的肠道细菌，对于科学家和医生来说具有重要的研究和治疗价值。

分离和鉴定大肠杆菌的方法有许多种，本篇文章将介绍几种比较常见的方法。

1. 感染部位样本的获得
首先需要获得感染部位的样本，可分为分泌物、血液、尿液、粪便等。

获得样本的方
法可以根据不同部位进行取样，比如粪便可以通过肛门插入取样器进行获取。

2. 抗生素筛选
将样本接种于相应的富营养基质，对其中加入多种抗生素。

根据对应的扩散系数，只
有大肠杆菌具有生长优势，因此只有大肠杆菌能够在抗生素的存在下继续生长。

3. 纯化
从上面的富营养基质中挑选具有脐带颜色和形态特征的菌落，将其在富营养基质上进
行纯化。

纯化后的大肠杆菌能在多种富营养基质上进行生长即可分离。

4. 经典分离法
包括肉汤琼脂平板法、 MacConkey琼脂平板法、格拉莫琼脂平板法、 EMB琼脂平板法等一系列基本细菌检测方法。

1. 化学特性法
常用方法有氧化氨酸特性试验、熏蒸酸特性试验、脱氧氮碱试验、醛类试验等。

通过
观察变化与发色的差异，以及其化学反应程度来判断是否为大肠杆菌。

通过观察菌落形态、革兰染色阳性反应、运动情况、气体代谢情况等特性判断是否为
大肠杆菌。

可采用比色相比法、蛋白溶液胶片法、氧测定法、etc。

3. 抗原性鉴定
通过采用血相似抗原、鞭毛抗原、菌体抗原等抗原进行抗血清试验，来确定是否为大
肠杆菌。

仔猪大肠杆菌的分离鉴定及市售药物比较仔猪大肠杆菌是引起仔猪腹泻的常见病原菌之一，对仔猪的健康和生长发育造成严重影响。

对仔猪大肠杆菌进行分离鉴定并选择适当的市售药物进行比较，对于控制仔猪腹泻具有重要意义。

一、仔猪大肠杆菌的分离鉴定1. 样品采集为了分离鉴定仔猪大肠杆菌，首先需要收集相关的样品。

可以从仔猪粪便、肠道分泌物等样品中进行采集。

2. 分离培养将样品接种到含有适当选择性抑制剂和诱导剂的培养基中，进行培养。

利用大肠杆菌的生理生化特性进行分离纯化。

3. 鉴定检测通过形态学观察、生理生化试验和分子生物学方法进行鉴定检测。

包括菌落形态、革兰氏染色、氧化酶试验、发酵试验、PCR等方法。

二、市售药物比较1. 抗生素目前市面上常见的用于治疗仔猪大肠杆菌感染的抗生素包括青霉素、氨氯地平、头孢霉素等。

这些抗生素可以通过口服、注射等方式进行给药。

2. 肠道免疫调节剂除了抗生素外，还有一些肠道免疫调节剂也被用于治疗仔猪腹泻。

比如益生菌、益生元等产品，可以通过调节肠道菌群平衡，增强免疫力来缓解仔猪大肠杆菌感染引起的腹泻。

3. 中成药市面上还有一些中成药，如藿香正气水、黄连素片等，也被用于治疗仔猪大肠杆菌感染。

这些中成药多具有清热解毒、抗菌消炎等功效，对于缓解腹泻症状有一定效果。

三、药物比较及选择建议1. 疗效比较通过临床试验和实验室研究，可以对不同药物的疗效进行比较。

比如抗生素和肠道免疫调节剂在治疗仔猪大肠杆菌感染时的疗效、耐药性等进行比较和评估。

2. 安全性比较除了疗效之外，还要考虑药物的安全性。

比如抗生素的滥用可能导致细菌耐药和残留问题，而肠道免疫调节剂多具有较好的安全性。

3. 综合选择根据疾病的病原特性、个体动物的状态以及药物的疗效和安全性进行综合选择。

一般建议在临床治疗中，可以综合应用不同类型的药物，从不同角度进行治疗。

四、注意事项在选择和使用药物时，需要注意以下事项：1. 严格按照药品说明书和兽医指导进行用药，避免滥用和超量用药。

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大肠杆菌生态型的分离和鉴定大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，可以生长在肠道环境中，并对我们的身体有一定的影响。

在某些情况下，大肠杆菌可能成为宿主的潜在病原体，导致各种各样的疾病，对人类健康产生威胁。

因此，分离和鉴定大肠杆菌生态型具有重要的理论和应用价值。

1. 大肠杆菌的分离方法大肠杆菌生态型的分离可以采用直接接种和间接接种两种方法。

直接接种是指直接从样品中分离大肠杆菌。

样品可以是粪便、河水、土壤、食品等。

分离方法包括平板法、层析法、滤膜法等。

其中，平板法是最常用的方法。

将样品在平板上均匀涂抹并培养，然后观察生长的菌落形态，确定菌落是否属于大肠埃希菌属，并通过生化反应或分子生物学方法进行鉴定。

间接接种是指先将样品进行富集处理，然后再进行分离鉴定。

这种方法可以增加分离率。

常用的富集方法包括至少三次传代法、血琼脂富集法、浮游细胞富集法等。

2. 大肠杆菌的鉴定方法大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，常规鉴定常用的方法有生化鉴定、血清学鉴定、荧光抗体鉴定和分子生物学鉴定等。

生化鉴定是指通过观察菌落形态和生化反应来鉴定大肠杆菌。

例如：甲烷酸盐形成试验、尿素酶试验、氧化-还原试验等。

根据不同的鉴定结果来判断是否属于大肠埃希菌属。

血清学鉴定是指利用抗原抗体反应来鉴定大肠杆菌。

将尿液或血清等待测样品与大肠杆菌特异性抗体反应，通过反应产生的抗原抗体复合物来鉴定样品中是否存在大肠杆菌。

荧光抗体鉴定是指利用荧光标记的抗体与大肠杆菌的抗原结合，然后使用荧光显微镜观察荧光信号。

由于荧光抗体的检测灵敏度高，可以在高样品背景下检测到非常低的大肠杆菌浓度。

分子生物学鉴定是指通过PCR扩增、DNA杂交等方法来鉴定大肠杆菌。

这种方法可以检测到非常低的浓度，并具有高度的特异性。

综上所述，分离和鉴定大肠杆菌生态型是一项非常重要的任务。

研究大肠杆菌的分离和鉴定方法，有助于提高大肠杆菌相关疾病的诊断和治疗，从而保护人类健康。

鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏实验1 前言大肠杆菌是Escherich是在1885年发现的，在相当长得一段时期内，一直被当做正常菌群的组成部分，认为是非致病性的。

直到20世纪中叶，人们才认识到大肠杆菌是肠道常驻菌，分布非常广泛，并且一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物的致病性，尤其是对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症。

禽大肠杆菌病（Avian colibacil-losis）是由致病性大肠杆菌（Es-cherichia coli）引起的局部或全身性疾病，包括急性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、眼炎、关节炎、脐炎、肉芽肿以及肺炎等，最常见的为气囊炎、输卵管炎等【1-4】。

在临床上往往不单独发病，一般继发于一些病毒性如新城疫、马立克氏病、传染性支气管炎等。

1.1 大肠杆菌病的危害鸡大肠杆菌病发生较为严重，在鸡群中发病率为11%~69%，死亡率为3.2%~72.9%，本病常易成为其他疾病的并发病或继发病，特别是饲养环境和饲养管理条件不良，均可导致鸡大肠杆菌病的发生，若不及时防治，可继发其他病，如感染后对沙门氏菌、新城疫、法氏囊等细菌病和病毒病的易感性增高。

发病鸡群长时间出现零星死亡，累计死亡率在5％~20％．严重时甚至高达50％，对畜禽各中品种和不同畜禽均可感染发病，该病给养殖业带来了巨大的经济损失。

1.2 大肠杆菌病的危害特点1.2.1 抗原构造复杂和血清型极多大脯杆菌的抗原主要由茵体抗原(0)154个，荚膜抗原(K)89个，鞭毛抗原(H)49个。

1.2.2 传染途径多样大脑杆茵病既可蛭消化道、呼吸道感染发病，又可经交配、经蛋传播。

1.2.3 发病季节不定性大脑杆菌病一年四车均可发生，但冬春寒冷和气温多变车节多发。

1.2.4 易出现耐药株采用药物浩疗疲病，问接地控制了低耳龄雏鸡大厮杆菌痛的发生，但同时也培育了大量大脑杆菌耐药菌株。

1.2.5 病型复杂大腑杆菌病的病原性与某些血清型有关。

分离大肠杆菌的方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，常存在于人和动物的肠道中。

尽管大肠杆菌在正常情况下对人体有益，但某些菌株也可以引起严重的感染和疾病。

因此，分离大肠杆菌并进行进一步研究和鉴定是非常重要的。

本文将介绍几种常用的分离大肠杆菌的方法。

1. 纯培养基分离法纯培养基分离法是分离大肠杆菌的常用方法之一。

首先，可以使用选择性培养基，如MacConkey琼脂培养基，其中含有发酵大肠杆菌的特定物质（如乳糖）。

大肠杆菌能够利用乳糖产生酸，导致琼脂变成红色。

然后，从样品中接种适量的细菌在含有选择性培养基的琼脂平板上进行培养。

大肠杆菌会在琼脂上生长并形成典型的红色菌落。

2. 群体分离法群体分离法是一种通过分离菌落的方法来分离大肠杆菌的有效方法。

首先，将样品均匀涂布在含有琼脂的培养基上，并在适当的温度下进行培养。

大肠杆菌在琼脂上形成单独的菌落，而其他细菌可能形成不同形状或颜色的菌落。

然后，通过挑选典型的菌落进行分离并进行进一步鉴定。

3. 抗生素敏感性试验大肠杆菌对不同抗生素的敏感性有所不同，因此抗生素敏感性试验可以作为分离大肠杆菌的方法之一。

将大肠杆菌接种在含有不同抗生素的琼脂平板上，然后观察菌落的生长情况。

大肠杆菌对某些抗生素具有抗性，因此在含有这些抗生素的琼脂平板上，大肠杆菌的生长会受到抑制，而其他细菌则可能继续生长。

通过观察菌落的生长情况，可以初步判断出含有大肠杆菌的菌落。

4. 生化试验生化试验是一种通过检测大肠杆菌所产生的特定酶或代谢产物来分离和鉴定大肠杆菌的方法。

例如，大肠杆菌能够产生β-半乳糖苷酶，可以将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。

通过将大肠杆菌接种在含有乳糖的培养基上，并添加某种指示剂，如菲嗪红，可以观察到培养基的颜色变化。

如果大肠杆菌存在，培养基会变成黄色。

5. 分子生物学方法分子生物学方法是一种准确且快速的分离大肠杆菌的方法。

通过检测大肠杆菌特有的基因或DNA片段，如16S rRNA基因，可以准确鉴定大肠杆菌。

大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验1
实验目的：
2. 学会药敏试验的操作方法。

实验原理：
本实验采用分离培养法和生理生化试验法鉴定大肠杆菌，并进行药敏试验。

分离培养法：将待检菌涂布于无机盐蔗糖琼脂平板上，进行无菌措施后，封好后放置于37℃恒温培养箱中培养约24小时。

生理生化试验法：将培养好的菌涂布于氧气萎缩培养基上，培养几十小时后进行各项生理生化试验，如酸碱反应、气体产生、吸附染料、半胱氨酸脱羧反应等，以确定菌的生理特征。

药敏试验：将培养好的菌按黏贴法涂布于药敏试验纸片上，将纸片贴在特定的试验板上，经过孔隙效应作用后，观察菌株的生长情况，如有抑制则为敏感，无抑制则为耐药。

实验步骤：
1. 首先进行无菌操作，将待检样品均匀涂布于琼脂平板上，分别在不同方向进行划纹，待干燥后翻转培养。

2. 取出培养好的菌，进行生理生化试验。

如酸碱反应、气体产生等。

4. 将培养好的菌均匀涂布于药敏试验纸片上，用特定的试验板进行孔隙效应，作用时间为24小时。

5. 经过孔隙效应作用后，取下试验纸片，观察菌株的生长情况。

实验结果：
1. 经过无菌操作后，将待检样品成功涂布于琼脂平板上，实验结果为大肠杆菌生长良好。

2. 通过生理生化试验鉴定为大肠杆菌。

3. 药敏试验结果表明，待检菌株对甲氧苄啶、氯霉素等药品敏感，对红霉素等药品耐药。

结论：。