ThermoScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒适用于RT-qPCR

RNA Extraction Protocol1.实验原理异硫氰酸胍/苯酚法-----目前实验室使用的方法！✓细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放✓释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离细胞或组织1. 样品裂解2. 分离总RNA2.实验试剂与器材2.1实验试剂RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、DEPC 水，反转录试剂盒（Fermentas），cDNA纯化试剂盒（Promega），末端加尾酶TdT （Thermo）。

2.2实验器材微量移液器（Eppendorf），电泳仪，电泳槽，超净工作台，4℃低温离心机（Eppendorf），常温离心机（Eppendorf），匀浆机（IKA），高压蒸汽灭菌锅，通风橱，紫外分光光度计（Eppendorf），PCR仪（Takala），剪刀，镊子，0.2mL、1.5mL离心管，枪头。

3.实验前准备工作实验前将要用到的试剂配好（75%乙醇：75mL的无水乙醇+25mL的去离子水；DEPC水：在1000ml双蒸水中加入DEPC原液1ml，然后摇匀过夜），与离心管、枪头、剪刀、镊子（用DEPC水处理过的，浸泡过夜）一起灭菌（126℃，90min），之后剪刀和镊子最好在紫外灯下照射半小时。

提前20min打开低温离心机预冷。

准备两幅手套，一个口罩，塑胶手套不能离开通风橱，整个实验过程尽量降低外源RNA酶对样品中RNA的降解。

4.实验步骤4.1取样（1）组织样品：将组织在RNA保护液中用剪刀剪碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

（2）贴壁培养细胞：不须消化，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。

第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书2013-12-07 13:20:16Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379012001b)04896866001c************1红色TranscriptorReverseTranscriptase（逆转录酶）a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)•储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.22无色Transcriptor RTReaction Buffer(5×)（逆转录缓冲液）a) 1瓶，1 mlb) 1瓶，1 mlc) 2瓶，各1 ml• 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)3无色ProtectorRNase Inhibitor（RNase抑制剂）a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)•储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)4黄色/紫色Deoxynuc-leo-tideMix（dNTP）a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)• dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer（锚定oligo(dT)18引物）a) 1瓶，100 μl(50 μM)b) 1瓶，200 μl(50 μM)c) 2瓶，各200 μl(50 μM)6Random Hexamera) 1瓶，100 μl(600 μM)蓝色Primer（随机引物）b) 1瓶，200 μl(600 μM)c) 2瓶，各200 μl(600 μM)7绿色Control RNA（对照RNA）a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)•包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液8绿色Control Primer Mix PBGD（对照基因引物）a) 1瓶，40 μl•5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1瓶，1 mlb) 2瓶，各1 mlc) 3瓶，各1 ml注意：货号为***********和***********的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。

RevertAid第一链cDNA Synthesis试剂盒#K1621, #K1622分析证明书质量控制#K1621Lot采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物质量认证人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组成 (2)存储条件 (2)产品说明 (2)注意事项 (3)操作步骤 (6)RT-PCR (6)合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决 (10)** 一个单位的RiboLockRNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。

存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20°C。

对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。

产品说明RevertAid第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。

本试剂盒使用RevertAid M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。

该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。

试剂盒中含有RiboLock 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。

试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。

随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。

oligo(dT)18选择性和RNA 3’po ly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。

使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。

合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。

原发性高血压患者血清miRNA-663水平与RAAS生化标志物的相关性分析刘文果;陈石磊;万志佳;魏星【摘要】目的探讨原发性高血压患者血清miRNA-663水平与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)生化标志物的相关性.方法受试者分为原发性高血压组、健康对照组,每组50例.分别采用荧光实时定量聚合酶链反应、化学比色法及放射免疫法检测外周血血清miRNA-663、血管紧张素转换酶(ACE)活性,以及肾素(RA)、血管紧张素(Ang)Ⅱ 、醛固酮(ALD)的表达.结果相对于健康对照组,原发性高血压组患者外周血血清miRNA-663表达显著降低,ACE活性及RA、AngⅡ 、ALD表达均显著升高(P<0.01);原发性高血压患者血清miRNA-663水平与血清ACE活性及RA、AngⅡ 、ALD水平均呈显著负相关.结论原发性高血压患者外周血血清miRNA-663表达显著下调,RASS生化标志物显著升高,外周血血清miRNA-663表达与RASS生化标志物呈显著负相关关系.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2018(015)019【总页数】4页(P2899-2901,2905)【关键词】miRNA-663;高血压;肾素;血管紧张素转换酶;血管紧张素Ⅱ【作者】刘文果;陈石磊;万志佳;魏星【作者单位】重庆市结核病防治所检验科 400050;陆军军医大学军事预防医学院防原医学教研室,重庆400038;重庆市沙坪坝区妇幼保健计划生育服务中心检验科400030;重庆市奉节县人民医院检验科 404600【正文语种】中文【中图分类】R446.11原发性高血压是以血压升高为主要临床表现的综合征，是多种心、脑血管疾病的重要病因和危险因素。

原发性高血压会严重影响心、脑、肾等重要脏器的结构与功能，最终导致这些器官的功能衰竭，迄今其仍是心血管疾病死亡的主要原因之一[1-2]。

原发性高血压的发病机制十分复杂且不明确，目前研究表明原发性高血压是多因素、多层次共同作用的结果。

产品信息Thermo ScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642/onebio分析证书经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。

其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。

质量授权人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组分 (4)贮存条件 (4)产品描述 (4)重要提示 (5)RT-qPCR实验方案 (6)对照反应 (6)疑难解答 (7)参考文献 (8)试剂盒组分贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。

产品描述Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。

试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。

这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。

Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。

合成反应能在15-30分钟内完成。

Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。

试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。

Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。

重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。

通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。

用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。

一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。

由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。

规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。

试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。

PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。

结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。

保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。

注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。

2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。

3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。

4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。

5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。

6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。

生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。

cDNA 第一链合成试剂盒操作方法1、逆转录反应（ 1）在无菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA 0.5-1.0 μg(dN) 9 or oligo(dT) 18 100pmol（ 2）混匀后， 70℃变性 5min，将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以下成份：5×M-MLV Buffer 4μldNTPs（ 10mM each）RNasin 1μl 10U100mM DTTM-MLV Reverse Transcriptase 2μl 100UDEPC-treated water up to 20 μl（ 3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT) 18 引物时在42℃，使用随机引物(dN) 9 时在37℃下温育 1 小时。

（4） 94 ℃ 5min 终止反应后，冰上冷却。

（5）合成的 cDNA第一链可直接用于 PCR扩增或进行其它下游操作。

2、 PCR扩增（ 1）在 PCR薄壁管中加入以下试剂Synthesized cDNA 2-5 μl10×PCR Buffer 2μlUpper primer 10pmolLower primer 10pmoldNTPs（10mM each）0.5 μlTaq DNA Polymerase 1.5UddH2O up to 20 μl（ 2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。

94℃预变性 2.5min 。

进入下列30~40 个循环（此扩增条件仅供参考）：94℃30s， 60℃ 45s ，72℃ 1min ~3min。

最后 72℃延伸 7min。

注意事项1、确保 RNA完整性及纯度。

RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由 OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。

较纯的 RNA 样品 OD260/OD280比值通常为 1.8-2.0 ，若该比值偏低，应进一步纯化。

真核生物RNA样品电泳图谱 28s 和 18s 的比值约为 2:1 ，否则，表明有 RNA降解。

RevertAid第一链cDNA Synthesis试剂盒#K1621, #K1622分析证明书质量控制#K1621Lot采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物质量认证人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组成 (2)存储条件 (2)产品说明 (2)注意事项 (3)操作步骤 (6)RT-PCR (6)合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决 (10)** 一个单位的RiboLockRNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。

存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20°C。

对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。

产品说明RevertAid第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。

本试剂盒使用RevertAid M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。

该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。

试剂盒中含有RiboLock 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。

试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。

随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。

oligo(dT)18选择性和RNA 3’po ly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。

使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。

合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。

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•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明
•Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit是一套用于以RNA为模板高效合成第一链cDNA的完整系统，可合成长达13kb 的cDNA。

试剂盒配套提供的RiboLockRNase Inhibitor，可有效防止RNA模板的降解。

试剂盒配套提供oligo(dT)18引物和随机六聚体引物。

oligo(dT)18引物可以选择性地与mRNA中的poly (A)尾结合。

随机六聚体引物无需poly (A)尾，因此可转录mRNA 5’-端区域，也可以无poly
(A)尾的RNA (如micoRNA)为模板合成cDNA。

该试剂盒也可使用基因
特异性引物。

•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明优点：
•合成全长的第一链cDNA，最长可合成13kb的cDNA
•最佳反应温度为42℃
•完全一提供RT反应所需的所有组分
•应用:
•第一链cDNA合成，作为RT-PCR和实时RT-qPCR的模板
•构建全长cDNA文库
•反义RNA合成
•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明
•RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成全长cDNA
• 1 μg小鼠心脏总RNA作为模板，用oligo(dT)18 引物进行逆转录反应。

由此合成的cDNA，再作为Taq DNA Polymerase后续PCR扩增的模板。

末端2024 bp片段的成功扩增，表明长度为13.8 kb的全长RN***段得到成功的逆转录。

•。

通脉大生片对肾虚排卵障碍型不孕大鼠卵巢指数和 FSHRmRNA 表达的影响温莹莹;傅春华;弓丽华;黄金珠;周昕【摘要】目的：探讨以“补肾调冲法”立法的通脉大生片对排卵障碍型不孕（ ASR）大鼠卵巢FSHR mRNA表达的调节作用。

方法：选取9日龄SD大鼠，给予颈背部皮下注射丙酸睾酮，建立肾虚ASR大鼠模型，根据大鼠阴道涂片结果筛选造模成功大鼠，随机分组。

灌胃5周后处死，取卵巢，计算卵巢指数。

荧光定量RT-PCR检测计算各组大鼠卵巢FSHR mRNA表达量。

结果：与正常组FSHR mRNA表达量比较，模型组降低且差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组FSHR mRNA表达量比较，通高组、右归丸组上调，差异有统计学意义（P＜0.05），通中组、来曲唑组均上调，差异有显著统计学意义（P＜0.01），通低组升高，差异无明显统计学意义（P＞0.05）；通高、中组FSHR mRNA表达量上调幅度明显高于通低组，尤以通中组最显著。

结论：通脉大生片可治疗肾虚排卵障碍型不孕，其机制与调节FSHR mRNA的表达水平，提高卵巢反应性有关。

【期刊名称】《江西中医药》【年(卷),期】2014(000)012【总页数】4页(P23-26)【关键词】通脉大生片;排卵障碍;卵巢指数;FSHR mRNA【作者】温莹莹;傅春华;弓丽华;黄金珠;周昕【作者单位】成都中医药大学四川成都610075;成都中医药大学四川成都610075;成都中医药大学四川成都610075;成都中医药大学四川成都610075;成都中医药大学四川成都610075【正文语种】中文【中图分类】R285.5不孕症是妇科临床的常见病，正成为全球生殖医学领域一个紧迫和日益引起关注的热点与难点问题。

据统计不孕症在我国的发病率约为10%[1]，而排卵功能障碍型不孕约占女性不孕症的25%～30%[2]。

以“补肾调冲”立法的通脉大生片是成都中医药大学附属医院的院内制剂，应用于临床50多年，其促排卵作用已被大量临床病例所证实，具有确切疗效[3]。