细菌内毒素检验SOP

细菌内毒素检查SOP（动态浊度法）1．目的为规范细菌内毒素含量测定的操作，特制定本SOP。

2．范围本SOP适用于细菌内毒素含量测定的操作。

3．定义3.1.动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

3.2.细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

3.3.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

3.4.细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015 EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。

4．职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。

4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。

4.3.质量负责人/质量受权人负责本规程的批准。

4.4.QA负责本规程执行的监督。

5．引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部。

6．材料6.1.仪器设备细菌内毒素测定仪、漩涡混合器、干烤箱6.2.试剂及溶液6.2.1.鲎试剂6.2.2.细菌内毒素工作标准品：国家标准品或经过国家标准品标定的工作标准品。

6.2.3.细菌内毒素检查用水：内毒素含量应小于0.005EU/ml。

6.3.使用的器具移液器、无热原稀释管和反应管、无热原枪头。

7．流程图无8．程序8.1.原理细菌内毒素能激活鲎试剂(TAL)中的酶系统，使凝固酶原变成凝固酶，进而凝固酶再激活其中的凝固蛋白原变成凝固蛋白，呈现凝胶反应，动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，计算内毒素浓度与反应时间关系的双对数标准曲线，利用标准曲线对供试品的内毒素含量进行定量测定。

8.2.试验前准备8.2.1.采样管用硅胶塞塞口，经180℃干烤2小时，除内毒素备用。

1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。

2 范围适用于本公司质管部对注射用水的细菌内毒素检验。

3 责任检验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。

4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

4.1仪器、用具4.1.1天平、电热干燥箱、旋涡混合器、恒温水浴锅、反应试管、镊子（金属）、金属盒、移液器具，酒精灯、脱脂棉球、剪刀、砂轮、封口膜，记号笔。

4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。

4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

4.2.2鲎试剂4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。

按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。

λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。

反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ≤λc≤2.0λ时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。

每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。

4.4供试品干扰试验按鲎试剂灵敏度复核试验项下，用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数（MVD）的稀释液分别将同一支（瓶）细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的细菌内毒素溶液。

细菌内毒素检查—凝胶法标准操作程序1.简述本操作程序主要参照BP 2003 Appendix XIV C. Test for bacterial endotoxins中MethodA.Gel-clot method: limit test和Method B. Gel-clot method: semi-quantitative test以及《中国药典2010版附录ⅹⅡE细菌内毒素检查法》中凝胶法，结合实验室自身条件编写而成。

2.安全注意事项由于细菌内毒素对人体有毒害作用，且鲎试剂对人的危害作用尚不明确。

因此实验过程中一定要做好防护措施。

3.检验目的检验供试品中的的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。

4.检验原理本操作程序通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量检测内毒素。

5.供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。

一般要求供试品溶液的pH 值在6.0～8.0的范围内。

对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH 值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。

酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。

缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

6.供试品细菌内毒素的限值(L)药典有明确规定的按照药典规定值，如无规定需经计算得出，具体计算方法见各药典。

7.供试品最大有效稀释倍数(MVD)和最小有效稀释浓度的确定(MVC)最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数( 1→MVD )，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。

用以下公式来确定MVD，MVD=cL /λ。

式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU / ml 表示时，则c为1ml / ml ，当L 以EU / mg 或EU / U 表示时，c的单位需为mg / ml 或U / ml。

细菌内毒素检查操作规程1. 目的规范细菌内毒素检查操作2. 范围细菌内毒素检查操作3. 责任人检验员4.依据标准：中国药典2010年版二部附录XII E原理鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应机理，判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定。

5.内容5.1 设备：超净工作台电热干燥箱恒温水浴锅电热蒸汽灭菌器5.2.试剂，标准品，玻璃仪器细菌内毒素工作标准品：灵敏度和阳性对照鲎试剂（0.5EU/ml）无热原水玻璃注射针（1ml）、（20ml）具塞玻璃管20ml5.3.准备所有器具除热原玻璃器皿180℃干热2小时或121℃蒸汽灭菌30分钟后干燥无热原水灭菌注射用水或内毒素检查用水5.4 试验5.4.1.供试品数量：同一批号至少3个单位供试品供试液制备：取注射器抽取5 mL无热原浸提介质，连接于留置针连接座上，注入留置针内腔至导管末端，一起置于37℃恒温箱中浸提1小时。

将注射器中剩余浸提介质推注流过留置针内腔，收集全部浸提液进行试验，注入浸提介质不超过5mL。

5.4.2.供试品检查：将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。

细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5EU/ml，为阳性对照。

取10mm×75mm试管7支，2支加入0.1ml供试液,2支管加入0.1ml无热原水为阴性对照管，2支管加入0.1ml细菌内毒素工作标准品为阳性对照管，2支管加入0.1ml细菌内毒素工作标准品与0.1ml供试液为阳性干扰对照管再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。

轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃恒温水浴中保温60±2分钟，轻轻取出，观察结果。

5.4.4.结果判定：将试管缓慢倒转180℃，管内容物坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状和虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。

阳性对照管与阳性干扰对照管应为（+），阴性对照管应为（-），否则试验无效。

供试品管均为（-），判定产品符合规定。

1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。

2 范围适用于本厂质监科化验室对注射用水的细菌内毒素检验。

3 责任化验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。

4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

4.1仪器、用具4.1.1旋涡混合器、注射器（2.0ml、1.0ml）、注射针（6号、9号）、保鲜纸、试管（10×75 mm）、镊子（金属）、金属盒。

4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。

4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

4.2.2细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价应不小于2EU，不大于50EU。

4.2.3细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。

4.2.4鲎试剂：0.1ml/支（λ=0.5EU/ml）。

4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，1EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。

按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。

λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。

反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。

目的：规范细菌内毒素检验操作程序。

范围：适用于细菌内毒素检查操作。

责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。

内容 1准备工作 实验设备及用具1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml 、5ml ）、药匙、250℃烘烤1小时。

1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。

1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管 内毒素标准品与实验试剂1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。

1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜mL灭菌注射用水）。

1.2.3细菌内毒素国家标准品和工作标准品。

75%乙醇、铬酸洗液。

实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少60分钟。

恒温水浴箱内水浴温度调节到37±1℃。

2鲎试剂灵敏度复核根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ= EU/ml ），细菌内毒素工作标准品加入1ml 细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。

将工作标准品制备成2λ、λ、λ、λ四个浓度（ EU/ml 、 EU/ml 、 EU/ml 、 EU/ml ）例：工作标准品为160 EU/ml 时注意：每稀释一步均应在混合器上混匀30秒。

取18支 EU/ml鲎试剂，每支中加入水，然后分别加入中制备好的4个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加4支，；最后2支加入水作阴性对照。

将上述试管用医用胶布封口，垂直放入37℃±1℃水浴锅中，保温60±2分钟。

放入水浴前把水搅动几下，以使水温均匀。

再次检查温度是否在所要求的范围，注意保温和取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。

保温结束后将试管轻轻取出，缓缓转到180°，若关内形成凝胶，不变形、不从管壁滑落者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶变形从壁滑落者为阴性。

细菌内毒素检查—凝胶法标准操作程序1.简述本操作程序主要参照BP 2003 Appendix XIV C. Test for bacterial endotoxins中MethodA.Gel-clot method: limit test和Method B. Gel-clot method: semi-quantitative test以及《中国药典2010版附录ⅹⅡE细菌内毒素检查法》中凝胶法，结合实验室自身条件编写而成。

2.安全注意事项由于细菌内毒素对人体有毒害作用，且鲎试剂对人的危害作用尚不明确。

因此实验过程中一定要做好防护措施。

3.检验目的检验供试品中的的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。

4.检验原理本操作程序通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量检测内毒素。

5.供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。

一般要求供试品溶液的pH 值在6.0～8.0的范围内。

对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH 值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。

酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。

缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

6.供试品细菌内毒素的限值(L)药典有明确规定的按照药典规定值，如无规定需经计算得出，具体计算方法见各药典。

7.供试品最大有效稀释倍数(MVD)和最小有效稀释浓度的确定(MVC)最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数( 1→MVD )，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。

用以下公式来确定MVD，MVD=cL /λ。

式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU / ml 表示时，则c为1ml / ml ，当L 以EU / mg 或EU / U 表示时，c的单位需为mg / ml 或U / ml。

1目的建立细菌内毒素预试验操作规程，以指导检验人员的正确规范操作，为保证细菌内毒素检查凝胶法的准确性提供依据。

2适用范围适用于细菌内毒素检查法的“鲎试剂灵敏度复核试验”和“干扰试验”。

本规程参照《中国药典》2020年版四部-1143细菌内毒素检查法制定。

3职责进行细菌内毒素检查的操作人员严格按本规程进行操作。

4内容4.1基本原理4.1.1本法采用凝胶法，系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。

4.1.2鲎试剂灵敏度复核试验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

4.1.3干扰试验：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项目的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

4.1.4本试验操作过程应防止内毒素的污染。

4.1.5EU：内毒素单位，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。

4.1.6λ：鲎试剂的标示灵敏度，单位：EU/ml。

4.1.7MVD：最大有效稀释倍数，指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数。

4.2材料准备4.2.1细菌内毒素工作标准品：应经细菌内毒素国家标准品为基准标定效价；4.2.2鲎试剂：当使用新批号前，按《细菌内毒素预试验SOP》进行灵敏度检查；4.2.3细菌内毒素检查用水（BET水）：内毒素含量应＜0.015EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用；4.2.4供试品溶液：pH宜在6.0~8.0范围内，否则用已去除内毒素和干扰因子的酸、碱溶液或缓冲液调节。

4.3器具准备4.3.1移液枪、一次性除热源枪头（1000μL、200μL）；4.3.2剪刀、砂轮片、试管架、除热源试管、医用胶布；4.3.3恒温培养箱（37℃±1℃）、旋涡混合器、洁净工作台。

4.4鲎试剂灵敏度复核试验4.4.1试验过程：4.4.1.1根据当批鲎试剂的标示灵敏度（λ），把细菌内毒素工作标准品用适量BET水充分溶解，避免产生气泡，在旋涡混合器上混匀15分钟。

细菌内毒素检查SOP1.适用范围本标准适用于细菌内毒素的检查。

2.职责QC负责人监督检验员按SOP检查检验员严格该SOP检查3.内容3.1.原理用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定，内毒素的量用内毒素的单位(EU)来表示。

3.2.实验材料及用具3.2.1.电热干燥箱温度应能达到250℃。

3.2.2. 恒温水浴箱（37±1℃）。

3.2.3.温度计，精度在1℃以下。

3.2.4. 旋涡混合器。

3.2.5. 鲎试剂应具有国家主管部门批准文号。

3.2.6. 细菌内毒素工作标准品，应使用中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。

3.2.7. 细菌内毒素检查用水（含内毒素小于0.015EU的灭菌注射用水）。

3.3.准备工作3.3.1.试验所用器皿，250℃干烘至少≥60分钟。

3.3.2.鲎试剂灵敏度复核，按《中国药典》2005版三部287页进行。

3.3.3.供试品干扰试验，按《中国药典》2005版三部287页进行。

3.4.操作方法3.4.1. 试验准备将试验所用器皿用洗涤剂和自来水洗净除去水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余洗液洗净，在用新鲜蒸馏水冲洗干燥后，用锡箔纸密闭玻璃器皿口，放置适宜的密闭金属容器中，置烤箱中在250℃干烤至少1小时，容器在不打开包装的情况下可在一周内使用，否则须再加热除去热源。

3.4.2.内毒素标准溶液的制备3.4.2.1. 取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻屑落入瓶内。

3.4.2.2. 按使用说明书用移液管加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。

置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准品溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。

3.4.3. 供试品溶液的制备3.4.3.1 供试品最大有效稀释倍数的计算：MVD=λLC⨯L为供试品的细菌内毒素限值；λ为使用鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）；C为供试品的浓度，当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml。