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细菌内毒素检测方法验证方案起草人起草日期审核人审核日期批准人批准日期目的-------------------------------------------------------------------------范围-------------------------------------------------------------------------责任人----------------------------------------------------------------------内容-------------------------------------------------------------------------1.实验材料及用具-------------------------------------------------------2 实验准备----------------------------------------------------------------3.具体验证步骤----------------------------------------------------------3.1. 鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------3.2..干扰实验--------------------------------------------------------------3.3.供试品细菌内毒素检查--------------------------------------------4.验证结论--------------------------------------------------------------附：表1.鲎试剂灵敏度复核记录表2.干扰试验记录表3.细菌内毒素检查记录目的：为确保盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。
细菌内毒素检查记录（首页）总 页 分 页 检品编号： 检验日期： 检品名称：实验地点：一、 标准规定的细菌内毒素限度（L ）为： 二、 供试品溶液的制备： 1、 预试验确定的MVD 为 倍。
2、 取本品 ml ，加细菌内毒素检查用水 ml ，摇匀，精密量取 ml ，加细菌内 毒素检查用水 ml ，摇匀，即得。
三、 试验用细菌内毒素溶液的制备： 1、取一支细菌内毒素工作标准品，加入 ml 细菌内毒素检查用水 ml ，使溶解，得EU/ml 的试验用细菌内毒素溶液。
2、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 细菌内毒素检查用水 (EU/ml ) 3、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 细菌内毒素检查用水 (EU/ml ) 4、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 细菌内毒素检查用水 (EU/ml ) 5、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 细菌内毒素检查用水 (EU/ml ) 6、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 细菌内毒素检查用水 (EU/ml ) 四、 供试品阳性对照溶液的制备：1、取 ml ( EU/ml ），加入 ml 供试品溶液（ EU/ml )2、 取 ml (EU/ml ），加入 ml 供试品溶液（ EU/ml )3、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 供试品溶液（ EU/ml )4、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 供试品溶液（ EU/ml )5、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 供试品溶液（ EU/ml )6、 取 ml ( EU/ml ），加入 ml 供试品溶液（ EU/ml )检验者： 校对者： 室负责人:细菌内毒素检查记录（附页）检品编号. 检验日期：总分页页检品名称: 实验地点：仪器设备: 恒温箱（型号)保温温度:保温时间: 自至加样量及试验结果:结论：本品按《中国药典》2005年版二部附录XI E检验依据检验，结果检验者: 校对者: 室负责人:。
细菌内毒素检验记录检品名称批号批量检品规格检验依据检品来源检验日期完成日期试剂名称批号规格来源细菌内毒素工作品 EU细菌内毒素检查用水 ml鲎试剂EU/ml1、细菌内毒素工作标准品稀释：a、溶解：取 EU内毒素工作标准品，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底后启开备用，加细菌内毒素检查用水（BET水） ml复溶后置旋窝混匀器上混匀 min。
b、稀释：取上述细菌内毒素溶液 ml于无内毒素空安瓿瓶中加入 ml BET水置旋窝混匀器上混匀 s，即得1EU/ml细菌内毒素溶液；取1EU/ml细菌内毒素溶液 ml于无内毒素空安瓿瓶中加入 ml BET水置旋窝混匀器上混匀 s，即得ml（2λ内毒素阳性对照液）细菌内毒素溶液。
2、供试品溶液配制：取供试品溶液 ml于无内毒素空安瓿瓶中加入 mlBET水置旋窝混匀器上混匀s，即得。
3、供试品阳性对照液配制：取供试品溶液 ml于无内毒素空安瓿瓶中加入 mlBET水置旋窝混匀器上混匀s，取其溶液ml于2ml无内毒素空安瓿瓶中加入 ml 1EU/ml细菌内毒素溶液置旋窝混匀器上混匀 s，即得。
4、鲎试剂溶解：取 EU/ml鲎试剂，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底后启开加入BET水 ml，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解。
保温仪器编号：保温温度：℃保温时间（～）反应结果：（细菌内毒素限值：应不得过3EU/ml）平行量编号鲎试剂+检查用水+检测液12阴性对照鲎试剂+检查用水+检查用水供试品鲎试剂+检查用水+供试品阳性对照鲎试剂+检查用水+λ阳性对照液供试品阳性对照鲎试剂+检查用水+λ供试品阳性液注：检验结果为阳性用“+”表示，阴性用“-”表示。
结果判定：符合规定口不符合规定口检验人：检验时间：。
细菌内毒素挑战性试验记录
验证对象设备编号安置位置
验证起止日期
实验记录：
1.验证标的物的制备：标的物的细菌内毒素含量为Eu 。
1.1细菌内毒素工作标准品冻干品效价Eu 批号生产单位1.2制备方法：
2.设备装载内容：
3.验证标的物的放置位置：标的物用量支，编号
4.工艺：加热至℃，保温分钟。
5.检验：
5.1细菌内毒素工作标准品冻干品效价Eu，批号，生产单位
细菌内毒素检查用水（BET）批号规格ml/支生产单位鲎试剂灵敏度Eu/ml批号规格ml/支生产单位5.2将验证标的物取出，分别加入1ml细菌内毒素检查用水，振荡溶解。
5.3按细菌内毒素检查的标准操作规程对验证标的物进行检查。
细菌内毒素工作标准品的稀释
验正标的物溶解液的处理
合格标准：验正标的物的细菌内毒素含量应下降3个log。
结论：
检验人复核人。
细菌内毒素检测方法验证方案起草人起草日期审核人审核日期批准人批准日期细菌内毒素检测方法验证方案目的-------------------------------------------------------------------------范围-------------------------------------------------------------------------责任人----------------------------------------------------------------------内容-------------------------------------------------------------------------1.实验材料及用具-------------------------------------------------------2 实验准备----------------------------------------------------------------3.具体验证步骤----------------------------------------------------------3.1. 鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------3.2..干扰实验--------------------------------------------------------------3.3.供试品细菌内毒素检查--------------------------------------------4. 验证结论--------------------------------------------------------------附：表1.鲎试剂灵敏度复核记录表2.干扰试验记录表3.细菌内毒素检查记录细菌内毒素检测方法验证方案目的：为确保盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。
1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。
2 范围适用于本厂质监科化验室对注射用水的细菌内毒素检验。
3 责任化验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。
4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1仪器、用具4.1.1旋涡混合器、注射器（2.0ml、1.0ml）、注射针（6号、9号）、保鲜纸、试管（10×75 mm）、镊子（金属）、金属盒。
4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。
4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.2.2细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价应不小于2EU，不大于50EU。
4.2.3细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
4.2.4鲎试剂：0.1ml/支（λ=0.5EU/ml）。
4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，1EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。
λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。
细菌内毒素检查
3.干扰试验
3.1将供试品稀释至预试验中确定的不干扰稀释倍数。
3.2再用此稀释液将同一支细菌内毒素标准品稀释制成4个浓度，2λ，1λ，0.5λ，0.25λ
的含内毒素的供试品溶液。
标准品：10EU→1EU/ml→0.5EU/ml→0.25EU/ml→0.125EU/ml
供试品溶液的稀释：
2λ1λ0.5λ0.25λNC（加检查用水）○○○○
○○○○○
○○○○
○○○○○
供试品阳性对照：
2λ1λ0.5λ0.25λNC（加供试品溶液）○○○○
○○○○○
○○○○
○○○○○
3.3前提：1）当两组最大浓度2λ，均显“+”；最低浓度0.25λ，均显“—”，
阴性对照管（NC），均显“—”，结果方为可靠，有效。
2）内毒素检查用水制成的标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（E S）
E S=lg-1（∑Xs/4）Xs,X t——反应终点浓度的对数值。
E t=lg-1（∑X t/4）E S，E t——反应终点浓度的几何平均值。
当E S∈[0.5λ,2λ],E t∈[0.5E S,2E S]则认为供试品在该浓度下不干扰试验，
可在该浓度下对供试品进行试验。
注：建立新品种的细菌内毒素检查方法，每个厂家至少取3个批号（不包括亚批）的供试品，用2个以上的鲎试剂生产厂家的鲎试剂进
行干扰试验。
维生素C注射液中细菌内毒素的检查
一、实验说明
《中国兽药典》规定维生素C注射液中每1mg维生素C含内毒素量应小于0.020EU。
本试验采用凝胶限度试验进行检查。
通过本实验的训练，掌握细菌内毒素检查的操作技能。
二、仪器与试剂
（1）仪器
分析天平，电热干燥箱，恒温水浴箱或适宜的恒温器，水银温度计或酒精温度计，旋涡混合器，细菌内毒素光度测定仪器。
（2）试剂
注射用青霉素钠或其他注射剂，鲎试剂（应具有国家主管部门的批准文号）。
三、准备工作
（1）试验所用器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1 h，也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰细菌内毒素的检查。
试验操作过程应防止微生物的污染。
（2）鲎试剂灵敏度复核试验每批新的鲎试剂在用于试验前均要进行灵敏度的复核。
四、检查方法
按表6-3制备溶液A、B、C、D。
使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。
按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。
五、记录与结果判断。
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
定量测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
常用的方法是在250℃干烤至少30分钟，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0-8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。
酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的建立药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5E U/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h)。
样品种类：金黄色葡萄球菌件数：件送检日期：年月日样品编号：检测地点：食源性致病菌实验室检测日期：年月日检测项目：葡萄球菌肠毒素检测依据：GB 4789.10—2010 附录B 环境条件：℃％RH 检测仪器：恒温摇床酶标仪离心机仪器编号： 162967—84 21659 01 培养温度：℃仪器状态：正常异常空白对照：一、试剂：营养琼脂批号：；产毒培养基批号：；A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒批号：；生理盐水配置日期：。
二、待检样品总数份，合格样品份，不合格样品份。
备注：三、检测步骤待测菌株接种营养琼脂斜面℃培养h ，用5mL生理盐水洗下菌落倾入mL产毒培养基中，每个菌种种一瓶，℃振荡培养h，振荡速度为100次/min，吸出菌液离心，8000r/min 20min，加热100℃,10 min，取上清液，取100 µL稀释后的样液进行试验。
将样液加入微孔条的A—G 孔，每孔100µL,，F孔和G 孔是阴性质控，H孔加100µL的阳性对照，用胶纸封住置℃孵育1h，洗板4次，每孔加入100µL的酶标抗体1，置℃孵育1h，再洗板4次，每孔各加100µL酶标抗体2 ℃孵育30 min，洗板4次后加底物，℃黑暗孵育15 min，然后每孔加100µL的2moL的硫酸终止液，30 min内用酶标仪在450nm和630nm波长条件下测量每个微孔溶液的OD值。
临界值= (F孔OD值+ G孔OD值)÷2+0.15 注：H孔的OD值要大于1，F与G孔的OD值均值要小于0.2。
OD值小于临界值的为阴性，大于临界值的为阳性。
检测者：年月日复核者：年月日HJK/BG/ZY/WJ-013 北京市海淀区疾病预防控制中心微生物检测原始记录样品受理号：第页共页检测者：年月日复核者：年月日。
目的---------------------------------------------------------------------------------------------------------范围---------------------------------------------------------------------------------------------------------责任人-----------------------------------------------------------------------------------------------------内容--------------------------------------------------------------------------------------------------------1.实验材料及用具-------------------------------------------------------------------------------------2.具体验证步骤-----------------------------------------------------------------------------------------2.1. 鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------------------------------------2.2..干扰实验---------------------------------------------------------------------------------------------2.3.供试品细菌内毒素检查--------------------------------------------------------------------------3. 验证结论----------------------------------------------------------------------------------------------附：表1.鲎试剂灵敏度复核记录表2.干扰试验预实验表3.干扰试验记录表4.细菌内毒素检查记录目的：为确保注射用重组抗Her2单克隆抗体细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。
