细菌内毒素检查标准操作规程..

细菌内毒素工作标准品检验操作规程部门质量控制部题目细菌内毒素工作标准品检验操作规程起草审阅批准共2页编号 HY/02-ZK-203 执行日期页码第1页细菌内毒素工作标准品检验操作规程一、范围:本标准规定了细菌内毒素工作标准品的测定方法和操作要求;适用于本公司细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素质控品的质检测定。

二、引用标准:2010年版《中国药典》附录“细菌内毒素检查法”三、要求:1、操作环境:温度不得高于26?，湿度不得高于75%;2、标准品:细菌内毒素国家标准品。

五、操作步骤:3(效价测定以国家标准品为基准，随机取本品2支，使用同一批鲎试剂参考品测定，2支反应终点的均值应与国家标准品的效价相平行或一致。

3.1 凝胶法3.1.1 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素国家标准品用检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成4个浓度的标准内毒素溶液，即2λ、λ、0.5λ和0.25λ备用,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。

3.1.2 设待复核的细菌内毒素工作标准品效价为P，用1ml检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成6个浓度的内毒素溶液，即(P/4λ)倍、(P/2λ)倍、(P/λ)倍、(2P/λ)倍、(4P/λ)倍和(8P/λ)倍备用,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。

3.1.3 细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品稀释须同时进行。

3.1.4 按《细菌内毒素检查法》项下操作，每一个内毒素浓度平行做4管。

如细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品的最大浓度4管均为阳性，最低浓度4管均为阴性，按下式计算细菌内毒素国家标准品反应终点浓度的几何平均值(E)和细菌内毒素工作标准品反应终点浓度对应的稀释倍数的几何平均值(D)。

-1其中E=1g(?X/4)式中 X为细菌内毒素国家标准品反应终点浓度的对数值(1g);-1D=1g(?X/4) 1式中 X为细菌内毒素工作标准品反应终点浓度对应的稀释倍数的对数值(1g)。

细菌内毒素检查标准操作规程1 简述1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。

后者包括浊度法和显色基质法。

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

1.2 供试品细菌毒素限值的确定。

（一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；（二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。

K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。

其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂，K=0.2EU/kg/h。

M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。

药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。

1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算：MV D=C·L/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。

当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml或U/ml。

如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。

λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。

1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。

1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。

光度法内毒素操作规程1. 背景介绍内毒素是一种常见的细菌产生的有毒分子，常见于细菌培养过程中的细胞壁释放物。

内毒素的存在会对生物体产生一定的毒性作用，因此在实验室中进行内毒素的检测和处理非常重要。

光度法是一种常用于内毒素检测的方法，通过测定溶液中光吸光度的变化来间接判断内毒素的含量。

本文档旨在规范光度法内毒素的操作流程，确保实验的准确性和安全性。

2. 实验材料和仪器•内毒素标准溶液•纯水•紫外可见分光光度计•塑料试管•称量器具•移液器3. 实验步骤3.1 样品制备1.将内毒素标准溶液稀释为适当浓度。

2.准备一个空白对照组，使用纯水替代内毒素标准溶液。

3.2 光度法测量1.将准备好的内毒素标准溶液和空白对照组分别倒入两个塑料试管中，每组至少三个重复样品。

2.使用紫外可见分光光度计设置波长为合适的吸光波长。

（根据标准溶液的特性和仪器的要求选择波长）3.在纯水中调零仪器，并将光路调整为最佳状态。

4.依次将样品放入光度计，记录各样品的吸光度值。

5.计算各样品的平均吸光度值并计算差值，以得到内毒素的含量。

3.3 数据处理和分析1.将各样品的吸光度值平均后的数据整理成表格或图解形式。

2.使用合适的统计方法进行数据分析，如方差分析或t检验等。

3.根据分析结果判断内毒素含量的差异是否显著。

4. 安全注意事项•实验过程中需佩戴实验手套和防护眼镜，避免内毒素对人体的直接接触。

•各种试剂和溶液应妥善保存，防止误用和污染。

•实验过程中如有意外溅洒等情况发生，应立即用大量清水冲洗受影响的部位，并寻求医疗帮助。

5. 结论本文档按照光度法的操作规程，介绍了光度法内毒素的实验步骤和安全注意事项。

通过标准溶液的测量和数据分析，可以得到准确的内毒素含量。

在进行实验过程中，实验人员应严格遵守操作规程，并做好必要的安全措施，以确保实验结果的准确性和人员的安全。

版本号：V01质量控制文件—检验方法禁止复印受控号：细菌内毒素检查法颁发部门：质量保证部生效日期：年月日分发清单:质量控制部责任人起草人审核人审核人批准人部门质量控制部质量控制部质量保证部质量负责人姓名签名日期版本号：V01质量控制文件—检验方法禁止复印1 目的为确保药品检验的准确有效，建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。

2 范围适用于细菌内毒素的检查。

3 定义与缩写3.1细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

3.2细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品：除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。

3.3细菌内毒素检查用水：系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。

4 职责4.1 质量控制部QC人员：负责执行本规程。

4.2 QC主管：负责监督本规程的实施。

5 内容5.1设备用具5.1.1实验设备：电热干燥箱（250℃以上）、内毒素凝胶法测定仪（37±1℃）、旋涡混合器。

5.1.2实验用具：刻度吸管、吸耳球、试管、试管架、封口胶、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、秒表、记号笔、取样瓶、可调微量移液器及配套玻璃吸头。

5.2试剂：鲎试剂（其标示值用λ表示）、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。

5.3试验准备5.3.1洗液的配制：称取重铬酸钾200g，用少许热水溶解后，加浓硫酸至5000ml。

5.3.2 玻璃器皿的洗涤：将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗版本号：V01质量控制文件—检验方法禁止复印液中泡至少4小时取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲后置适宜的密闭金属容器，迅速置烤箱中。

5.3.3除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素：玻璃器皿置烤箱后经250℃干烤30分钟以上，除去热原。

5.4 鲎试剂灵敏度复核试验5.4.1在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU／ml表示。

GMP管理文件一、引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。

二、目的：本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。

三、适用范围：适用于细菌内素毒素的检查。

四、责任者：质检人员。

五、正文：1、简述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显基质法。

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。

光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。

常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

试验操作过程应防止微生物的污染。

供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。

一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。

对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。

酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。

缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

最大有效稀释倍数（MVD）的确定最大有效稀释倍数是指在试验中供试品被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。

09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程——————————文件类别：技术标准 1/101.目的：建立细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。

2.依据：2.1.《中华人民共和国药典》2010年版一部。

3.范围：适用于所有用细菌内毒素检查法(一部)测定的供试品。

4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。

5.正文：5.1. 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

5.1.1. 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。

5.1.2. 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。

5.1.3. 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。

用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

5.1.4. 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

5.1.5. 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。

5.1.6. 试验所用器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。

耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

5.2. 供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。

一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。

细菌内毒素检查仪安全操作及保养规程细菌内毒素检查仪是一种测定样品中是否存在内毒素的仪器。

在使用该仪器时，需要严格遵守操作规程，以确保实验安全和数据准确性。

本文将介绍细菌内毒素检查仪的安全操作和保养规程。

操作规程前期准备在操作细菌内毒素检查仪之前，必须进行以下准备：1.确定实验室内符合要求的工作环境。

2.按照厂家提供的操作手册检查仪器的完整性和性能是否正常。

3.预热仪器至稳定状态，通常需要30分钟左右。

样品操作1.打开仪器，等待其进入空闲状态。

2.将标准样品和待测样品稀释至一定浓度，并加入到试剂盘中。

3.将试剂盘放入仪器中，并按照操作手册的要求启动检测程序。

4.在仪器完成检测后，从试剂盘中取出样品，并关闭仪器。

清洗操作1.在取出试剂盘后，立即将试剂盘中的残留试剂倒掉。

2.对试剂盘进行物理清洗。

使用化学溶剂前请先了解溶剂的物理性质，注意防止划伤、断裂和溅泼等情况的发生。

3.重新装载试剂盘，并进行仪器的预热步骤。

技术要求1.操作者必须经过相关培训，了解细菌内毒素检查仪的操作原理和方法。

2.操作者必须佩戴适当的防护装备，如实验手套、护目镜等。

3.操作者必须在出现故障或异常状况时立即停止检测并联系维修人员。

保养规程以细菌内毒素检查仪为例，保养规程分为日常保养和定期保养两部分。

日常保养日常保养是指在每天使用仪器之前和之后的清洁和检查。

具体操作如下：1.清洁仪器表面，用柔软的布擦拭干净，不要使用含有毒性的化学试剂进行清洁。

2.清洁试剂盘，用芳香性清洁剂清洗并擦干，不能用水清洁，避免产生水渍或氧化。

3.检查试剂盘、样品载架和其他仪器部件是否完好无损，如损坏应及时更换。

定期保养定期保养是指细菌内毒素检查仪在长时间使用或维护保养期间需要进行的操作。

具体操作如下：1.仪器的芯片和电子部件可能存在老化、腐蚀、锈蚀等情况，因此定期对仪器进行内部清晰和检修。

2.定期对仪器进行校准，可在正常操作前进行，以保证检测准确性。

3.定期检查仪器的电源线和接线是否存在磨损、剥皮、断裂或腐蚀等情况，避免电源线或接线出现不良现象，如如有出现及时更换电源线或接线。

细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。

后者包括浊度法和显色基质法。

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L＝K∕M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。

K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg·h) 表示。

其中注射剂，K＝5EU／(kg·h)；放射性药品注射剂，K＝2.5EU ／(kg·h)；鞘内用药品，K＝0.2EU／(kg·h)。

M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／(kg·h)、mg／(kg·h)、U／(kg·h) 等表示。

药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。

若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：（最大给药剂量／(m２·h)×1.62m２）／60kg］。

1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：MVD＝C·L／λL为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L 的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml 或U／ml。

λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。

供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：MVC＝λ／L。

1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。

2 范围适用于本厂质监科化验室对注射用水的细菌内毒素检验。

3 责任化验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。

4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

4.1仪器、用具4.1.1旋涡混合器、注射器（2.0ml、1.0ml）、注射针（6号、9号）、保鲜纸、试管（10×75 mm）、镊子（金属）、金属盒。

4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。

4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

4.2.2细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价应不小于2EU，不大于50EU。

4.2.3细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。

4.2.4鲎试剂：0.1ml/支（λ=0.5EU/ml）。

4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，1EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。

按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。

λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。

反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。

正文规范细菌内毒素工作标准品效价的标定程序，确保细菌内毒素检查结果的可靠性。

适用于质监处药理室对细菌内毒素工作标准品效价的标定。

质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。

USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。

细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。

鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。

鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。

细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。

细菌内毒素参考标准品(RSE)：RSE 是USP细菌内毒素参考标准品，每瓶有10,000个USP 内毒素单位。

细菌内毒素工作标准品(CSE)：是除RSE 之外的内毒素标准品。

反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。

一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。

细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。

细菌内毒素工作标准品(CSE) 批号、效价、生产商。

细菌内毒素参考标准品(RSE) 批号、效价、生产商。

材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。

电热鼓风干燥箱型号、设备编号。

正文漩涡混合器型号。

无热原试管规格：1075mm。

无热原玻璃瓶规格：25ml。

无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。

试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。

二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。

试验操作过程应避免微生物的污染。

三、内毒素溶液配制USP细菌内毒素参考标准品(RSE)系列溶液配制取RSE 1瓶，加入5ml细菌内毒素检查用水溶解并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。