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HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
高效液相色谱法高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录V D)系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带人柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局"液相色谱仪检定规程"定期检定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等〉也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm(lnm= lOA)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10µm之间。
粒径更小(约2µm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40°C，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60°C。
流动相的pH值应控制在2～8之间。
当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
达到传质阻力小，分离效率高。
早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，液膜厚度d f大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。
现代HPLC填料大多采用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。
高效固定相会带来什么新问题呢？使用高效填料带来两个新问题：一是柱流动阻力大大增大，因此需要采用高压泵输液；二是表面能很大，要采用专业的装柱技术。
高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上发展起来的。
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。
不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。
高效液相色谱的原理与经典液相色谱相同，但是它采用了高效色谱柱、高压输液泵和高灵敏度检测器。
因此，高效液相色谱的分离效率、分析速度和灵敏度大大提高。
定量准确，达到可与GC相媲美的分离分析性能。
特别是结合计算机技术，HPLC已成为高度自动化和智能化的现代分析仪器。
经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长，例如柱长170㎝，柱内径0.9㎝，流动相速度30㎝3/h，约需20多小时才能分离出20种氨氨基酸；而用高效液相色谱法，只需1小时之内就完成。
而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送，色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料（几微米至几十微米）填充而成，均匀、规则的固定相，传质阻力小，分离效率高。
柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或100几十万），同时柱后连有高灵敏度的检测器，使分析灵敏度比经典色谱有较大提高。
例如，用紫外检测器最小检测限可达到10-9g，而荧光检测器则可达到10-11g。
虽然气相色谱法是一种很好的分离、分析方法，它具有分析速度快、分离效能好和灵敏度高等优点。
但是气相色谱仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质。
据估计，在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15％，加上制成衍生物的化合物，也不过20％左右。
由于大量有机物、离子型化合物易受热分解或失活物质不能用GC分析，因此需要发展HPLC。
对于高沸点化合物；难挥发及热不稳定的化合物、离子型化合物及高聚物等，很难用气相色谱法分析。
为解决这个问题，70年代初发展了高效液相色谱。
由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大（大于400）的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化合物总数的75-80%。
因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的分离和分析。
但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面，目前还不如气相色谱法。
此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。
二、高效液相色谱法与气相色谱法比较HPLC的保留值等色谱分析有关术语以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。
因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率方程H=A+B/u + Cu式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/u对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。
于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。
气相色谱（GC）的流动相流速u增大时，板高H显著增大（即柱效显著降低），而液相色谱（LC）的流速增大时，板高增大不显著（即柱效降低不显著）。
这说明高效液相色谱也有很高的分离效能。
HPLC可分离分析高极性、高分子量和离子型的各种物质。
柱效很高，每米可达3万块以上，一般用20 -- 25cm长的柱子，由于固定相的不断改进，最短的只有3cm ，理论板数可达3000--4000，能满足一般分析的需要，而且具有很高的分析速度。
柱子短，对压力要求就低。
过去高压，现在追求高精度、高稳定性，一般在室温下操作，样品不需预处理，操作方便，容易掌握。
液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：（一）应用范围不同液相色谱非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70～80%。
（二）流动相不同气相色谱的流动相载气是色谱惰性的永久性气体，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。
而在液相色谱中流动相是各种低沸点有机溶剂及水溶液。
也参与样品分子相互作用，因此液相色谱流动相的作用比气相色谱大。
气相色谱的载气仅数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。
而液相色谱的流动相种类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。
因对于LC来说，流动相的选择很重要，为提高选择性增加了一个因素。
液相色谱也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。
（三）液相色谱分离类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。
液相色谱能完成难度较高的分离工作。
就其分离机理的不同，高效液相色谱可分为液－固吸附色谱、液－液分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱等多种类型。
液—固色谱的色谱柱内填充固体吸附剂，由于不同组分具有不同的吸附能力，因此，流动相带着被测组分经过色谱柱时，各组分被分开。
液—液色谱的流动相和固定相都是液体。
作为固定相的液体涂在惰性担体上，流动相与固定液不互溶。
当带有被测组分的流动相进入色谱柱时，组分在两相间很快达分配平衡，由于各组分在两相间分配系数不同而彼此分离。
以非极性溶液作流动相，极性物质作固定相的液—液色谱叫正相色谱；极性溶液作流动相，非极性物质作固定相的液—液色谱叫反相色谱。
离子交换色谱的色谱柱内填充离子交换树脂，依靠样品离子交换能力的差别实现分离。
而凝胶色谱是按试样中分子大小的不同来进行分离的。
在上述四类色谱中，应用最广泛的是液—液色谱。
液相色谱作为分析时选择余地大，而气相色谱达不到。
（四）气相色谱一般都在较高的温度下进行分离分析，而液相色谱通常在室温条件下操作。
（五）柱外效应:由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，HPLC 的柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
（六）制备:液相色谱不仅可用于分离分析，还可用于制备纯样品。
液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。
回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备样品。
便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。
（七）检测器等:液相色谱尚缺乏高灵敏度、通用型的检测器，液相色谱柱子昂贵，要消耗大量溶剂，液相色谱仪器比较复杂，操作严格。
价格也较气相色谱仪昂贵，主是因为采用了高压泵。
在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
三、高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要分离类型有液－固色谱法（吸附色谱法）；液－液分配色谱法；化学键合相色谱法；离子交换色谱法；凝胶色谱法（体积排阻色谱法）。
其他色谱类型有：亲合色谱法（affinitychromatography(AC)）；手性色谱法（chiral chromatography(CC)）；胶束色谱法（micellar chromatography(MC)）；电色谱法（electrochromatography(EC)）。
第二节 高效液相色谱基本理论高效液相色谱的基本理论和定性定量分析方法与气相色谱基本相同。
在气相色谱法中表达分离过程的许多基本关系式，绝大部分适用于高效液相色谱法。
一、 保留值基本关系式t R =t R ‘+t M (8-1)保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法的重要参数。
保留时间由物质在色谱中的分配系数决定：t R =t M (1+KVs/V M )= t M (1+K/ß)= t M (1+k ) (8-2)ß=V M /Vs (8-3)k =K/ß= (t R -t M )/ t M (8-4)(8-1)式中t R 表示某物质的保留时间，t M 是色谱系统的死时间，即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间，这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定。
(8-2)式中K 为分配系数，Vs 、Vm 表示固定相和流动相的体积，ß为相比率。
k 为溶质在色谱柱中分离后的容量因子。
k 是决定组分保留的关键数值，在HPLC 中，测k 值不像GC 中那么容易，因为要找到一种完全不被保留的组分来测死时间是非常困难的，现在常用的方法是：在吸附色谱中，使用比流动相极性更弱的溶剂作为样品；在分配色谱中，使用重水（D2O ）作为样品。
