高效液相色谱的工作原理及操作注意事项

高效液相色谱仪的原理及应用
高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析仪器，根据物质在固定相和流动相
间的相互作用差异来实现物质分离和测定的方法。

高效液相色谱的主要原理如下：
1. 样品进样：样品通过进样器注入到流动相中。

2. 流动相泵：流动相泵将流动相以一定的压力送入进样阀。

3. 进样阀：进样阀控制样品的进入量，并通过连接固定相柱。

4. 固定相柱：固定相在柱中，对流动相和待分离的样品进行分离。

5. 检测器：根据样品的特性和分离程度选择合适的检测器进行检测。

6. 数据处理器：将检测的信号转化为柱温度、流量和检测器信号等数据。

高效液相色谱仪的主要应用包括：
1. 分析化学：用于定性和定量分析化学样品中的成分。

2. 生物化学：用于分析蛋白质、核酸、多肽等生物大分子。

3. 药学：用于分析药物中的活性成分、控制药品的质量。

4. 环境分析：用于监测环境中的有机污染物和无机物质。

5. 食品分析：用于检测食品中的添加剂、残留农药和毒性物质。

高效液相色谱仪的优点包括分离效率高、分析速度快、样品容量小、样品制备简单等。

然而，高效液相色谱仪的操作要求严格，仪器费用较高，且需要使用高纯度的溶剂和试剂。

高效液相色谱仪原理及操作步骤嘿，咱今儿个就来唠唠高效液相色谱仪这玩意儿！你可别小瞧它，它在好多领域那可都是大功臣呢！那高效液相色谱仪到底是咋工作的呢？简单来说啊，就好比是一场特别的赛跑。

不同的物质就像是不同的选手，它们在色谱柱这个“跑道”上奔跑。

由于各自的性质不同，跑的速度也就不一样啦，这样就能把它们一个一个地分开。

这就好比是一群人一起跑马拉松，跑得快的自然就先冲线啦，然后我们就能清楚地知道谁先谁后，这就是高效液相色谱仪的基本原理啦。

接下来咱说说操作步骤。

第一步呢，就像是准备比赛前要先做好热身一样，咱得把仪器调试好。

要检查各种部件是不是都正常，这可不能马虎，不然跑着跑着出问题了可咋办！然后呢，就是要把样品准备好。

这就像是给选手们准备好号码牌一样，得让它们有个“身份”呀。

样品的处理可得精心，不能有杂质啥的来捣乱。

接着就是进样啦，这就像是鸣枪起跑！把样品送进色谱柱这个“跑道”里，让它们开始“奔跑”。

在这个过程中，可别闲着呀，得时刻关注着仪器的运行状态。

就像看着比赛一样，看看选手们跑得顺不顺利。

等跑完了，数据出来了，那就像是比赛结束知道成绩了。

这时候可得好好分析分析这些数据，看看咱想要的结果在不在里面。

你说这高效液相色谱仪是不是很神奇呀？它能帮我们把那些复杂的混合物分得清清楚楚。

这要是没有它，好多实验可就没法做啦！咱再想想，生活中不也有很多类似的情况吗？就像整理东西，把乱七八糟的东西分类整理好，不就清楚多了嘛。

高效液相色谱仪不就是在微观世界里帮我们做这样的事情嘛。

所以啊，学会操作高效液相色谱仪那可太重要啦！这不仅是为了工作，也是为了能更好地探索那些我们看不见的世界呀。

你说呢？反正我觉得它真的是个了不起的家伙，能帮我们解决好多难题呢！。

液相色谱的原理以及操作要点液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种常用的分离和分析技术，它基于不同物质在流动相中的分配行为来实现分离。

本文将介绍液相色谱的原理，同时探讨液相色谱的操作要点。

一、液相色谱的原理液相色谱的原理主要基于两个关键概念：分配系数和吸附性质。

1. 分配系数分配系数（Distribution coefficient）是指样品在固定相和流动相之间的分配比例。

它是液相色谱中物质分离的基础。

分配系数的大小决定了物质在固定相上停留的时间，从而实现了不同成分的分离。

2. 吸附性质液相色谱还涉及到物质在固定相上的吸附行为。

当样品溶液通过固定相时，固定相表面上的吸附剂与样品物质发生相互作用，使得物质被吸附，从而发生分离。

二、液相色谱的操作要点为了有效地进行液相色谱实验，以下是一些操作要点需要注意：1. 样品制备样品制备是液相色谱分析的首要步骤。

样品应准备恰当，并考虑到溶解度、稳定性以及待分析物之间的相互干扰。

此外，样品需要经过适当的前处理（如过滤、稀释等）以达到分析要求。

2. 流动相选择流动相的选择对液相色谱分离效果起到至关重要的作用。

合适的流动相应能够与待分析物有良好的相容性，并且具有适当的溶解性和流动性。

常用的流动相包括水、有机溶剂和缓冲溶液。

3. 固定相选择固定相是液相色谱中的另一个关键部分。

不同的固定相具有不同的化学性质，因此会影响到分离的选择性和效果。

根据待分析物的特性，选择合适的固定相对于分离效果至关重要。

4. 色谱柱选择色谱柱是液相色谱系统中用于分离的核心组成部分。

不同的色谱柱具有不同的长度、直径和固定相材料，这些参数会影响到分离性能和分析时间。

根据待分析物的特性和分离要求，选择合适的色谱柱尤为重要。

5. 色谱条件优化为了获得最佳的分离效果，需要进行色谱条件的优化。

例如，可以调整流速、梯度程序和柱温等参数，以达到更好的分离和峰形。

6. 数据处理和解释液相色谱实验完成后，需要对得到的色谱图进行数据处理和解释。

HPLC高效液相色谱仪工作原理操作、维护
要点的梳理总结
HPLC（高效液相色谱）是一种常见的分析仪器，用于分离、鉴定和定量分析化合物。

下面是HPLC高效液相色谱仪的工作原理、操作和维护要点的梳理总结：
工作原理：
1. 样品通过高压注射器注入进入液相色谱柱，柱内填充有固定相（如硅胶或离子交换树脂），流动相（溶剂）通过柱子，样品中的化合物在不同的固定相上有不同的分配系数，从而被分离出来。

2. 分离后的化合物通过检测器进行检测，检测器将化学信号转换为电信号，然后通过数据系统进行数据处理，得到化合物的保留时间、峰面积等信息。

操作要点：
1. 准备工作：检查仪器是否正常工作，准备好样品，选择合适的溶剂进行样品制备和提取。

2. 启动仪器：启动仪器，调节流速、温度等参数，使其达到预设值。

3. 注入样品：通过注射器注入样品，注意控制注入速度和量。

4. 运行分析：启动色谱柱和检测器，开始进行分析。

5. 数据处理：通过数据系统对分析结果进行数据处理，得到化合物的保留时间、峰面积等信息。

维护要点：
1. 定期清洁和维护仪器：定期清洁仪器，更换滤芯和柱子，保证仪器的正常工作。

2. 定期校准仪器：定期对仪器进行校准，保证分析结果的准确性。

3. 注意安全操作：在操作过程中应遵守安全规范，避免意外事故发生。

4. 储存样品：储存样品时应注意保存条件，避免样品变质或污染。

总之，HPLC高效液相色谱仪的工作原理、操作和维护要点都需要认真掌握，才能保证分析结果的准确性和仪器的正常工作。

高效液相色谱仪操作说明书一、引言高效液相色谱仪（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物医药、环境监测等领域的分析仪器。

本操作说明书旨在帮助用户正确有效地操作HPLC仪器，以获得准确可靠的分析结果。

二、仪器概述1. 主要组成：HPLC仪器主要包括进样系统、色谱柱、流动相装置、检测器及数据分析系统等组成部分。

2. 基本原理：HPLC利用流动相在高压下通过色谱柱，样品分离后再由检测器进行检测和信号记录，通过数据分析系统生成分离效果图谱或定量结果。

三、操作步骤1. 准备工作a) 确保仪器电源已接通，并检查各部分连接是否牢固。

b) 打开相关软件并进行系统初始化。

c) 根据待分析样品的特性，选择适宜的色谱柱和流动相。

2. 进样系统操作a) 将待测样品通过合适的方法制备成溶液。

b) 打开进样系统的相关开关，将样品通过进样针注入进样口。

c) 调整进样量和进样速度，确保样品完全被进样器吸取。

3. 色谱柱操作a) 将色谱柱连接到系统中，并确保连接处密封良好。

b) 根据样品性质选择合适的流动相和梯度条件，设置柱温以提高分离效果。

c) 在柱前和柱后设置适当的减压阀，调节流量和压力，确保色谱柱正常运行。

4. 流动相装置操作a) 根据检测要求准备合适的流动相溶液。

b) 将流动相溶液通过流动相装置输送至色谱柱，确保流速和流量稳定。

5. 检测器操作a) 打开检测器并进行相关参数设置，如波长选择、灵敏度调节等。

b) 将流经色谱柱的样品原液通过检测器进行检测，并记录信号。

6. 数据分析与结果生成a) 使用相应的数据分析软件，导入检测到的信号数据。

b) 根据需求进行峰面积积分、峰高浓度定量等相关数据分析。

c) 生成分析图谱或报告，并保存结果。

四、故障排除在操作过程中，可能会遇到一些故障情况，以下列举一些常见故障及其排除方法：1. 柱堵塞：检查柱前和柱后的减压阀是否打开和调整流量。

2. 波峰异常：检查流动相和检测器参数设置是否正确。

3. 信号丢失：检查进样系统是否正常工作，检查柱连接是否存在泄漏。

高效液相色谱仪操作使用过程中的注意事项一，高效液相色谱仪操作过程：1、开机操作：（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）；（2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）；（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。

2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。

冲洗过程中关闭D灯、W灯；7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。

（续）1、操作过程若发现压力很小，则可能管件连接有漏，注意检查。

当出现错误警告（各组件指示灯均为红色），一般为漏液，其中一个感应器中已有溶剂，漏液故障排除后，擦干，点击On line操作界面中的Instrument/System Off，然后再点击操作界面中的Instrument/System On即可。

高效液相色谱仪操作规程一、目的：建立高效液相色谱仪的标准操作规程二、适用范围：本规程适用于本公司高效液相色谱仪操作规程的操作三、职责：质量检验员对本标准的实施负责四、正文：1.工作原理高效液相色谱是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品,由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由积分仪记录，得到的信号-时间曲线。

2.系统适用性按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,包括以下要求：色谱柱的理论板数（N）：理论板数应高于各品种项下规定的最小理论板数，若理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等）使理论板数达到要求。

分离度和拖尾因子：除另有规定外,分离度应大于1.5T应在0.95～1.05之间。

3.仪器组成本系统由LC-15ATvp溶剂输送泵、手动进样阀7725i、SPD-15Avp紫外检测器、Lcsolution工作站、电脑和柱温箱等组成。

4.准备4.1根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（箭头依次朝上）。

4.2检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

4.3准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，用吸气减压装置脱气。

4.4按标准操作规程配制样品和对照溶液，用合适的0.45 m滤膜过滤。

5.开机接通电源，依次开启泵，检测器（在进样前30min打开）、Lcsolution工作站。

5.1 LC-15C泵操作5.1.1逆时针转动泵的排液阀180°，打开排液阀；5.1.2按泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min(可设定)的流速冲洗，5min（可设定）后自动停止；5.1.3将排液阀顺时针旋转到底,关闭排液阀。

如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。

5.2 SPD-15A检测器参数设定5.2.1检测器显示屏显示λ（NM） abs (AV) range (AUFS) 1amp254 0.000 0.001 D“λ（NM）”项为波长，“abs (AV) ”项为吸光度，“range (AUFS) ”项表示量程，“1amp”项表示氘灯。

高效液相色谱仪的操作流程和注意事项引言：高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种重要的分析仪器，广泛应用于化学、生物、医药等领域。

掌握正确的操作流程和注意事项，对保证分析的准确性和结果的可靠性至关重要。

下面将详细介绍高效液相色谱仪的操作流程和注意事项。

一、仪器准备在开始操作高效液相色谱仪之前，需要进行一些准备工作。

首先，检查仪器是否正常工作，例如电源是否正常接通，各个模块是否连接牢固等。

其次，确保色谱柱处于良好的工作状态，即没有泄漏和堵塞等问题。

最后，根据需要，选择合适的检测器，并校准相应的参数。

二、样品准备和进样样品的准备是操作高效液相色谱仪的关键一步。

首先，根据样品的性质选择合适的溶剂体系，并将样品完全溶解。

其次，为了提高分析的准确性，通常需要对样品进行预处理，例如磷酸酯酶的样品需要经过脱磷酸处理。

最后，将样品装入进样瓶中，根据仪器的要求设定进样量。

三、流动相的选择和准备流动相是高效液相色谱仪中的关键因素之一。

在选择流动相时，需要考虑样品的性质以及分析的目的。

常见的流动相包括有机溶剂、水以及它们的混合溶液。

在选择后，需要准备流动相，并进行除气处理以去除气泡。

此外，还要注意流动相的质量，例如pH值、浓度等。

四、色谱条件的设置色谱条件是操作高效液相色谱仪的关键之一。

根据分析的目的和样品的性质，需要设置合适的参数，例如流速、温度、梯度等。

在设置前，需要根据样品性质选择合适的色谱柱，并设定相应的温度以优化分离效果。

此外，还需要根据检测器的要求设定相应的参数。

五、数据采集和结果分析在操作高效液相色谱仪时，需要进行数据采集和结果分析。

首先，确保数据采集系统正常工作，并根据仪器的要求进行设定。

其次，启动数据采集并进行监控，及时记录实验过程中的各项指标。

最后，对采集的数据进行处理和分析，例如峰面积的计算、峰形的分析等。

注意事项：1. 严格按照操作流程进行操作，避免任意更改设置。

高效液相色谱仪的基本构造和工作原理一、概述高效液相色谱（HPLC）是一种广泛应用于化学、制药、食品、环保等领域的重要分离分析技术。

其通过高压泵推动流动相通过色谱柱，实现样品中各组分的分离，并通过检测器对分离后的组分进行检测。

本文将详细介绍高效液相色谱仪的基本构造和工作原理。

二、基本构造1. 流动相储存器：用于储存流动相，通常为高压密封容器，可确保流动相的纯度和稳定性。

2. 高压泵：为色谱分离提供动力，推动流动相通过色谱柱。

高压泵应具有稳定的输出压力和流量，以保证色谱分离的效果。

3. 色谱柱：是HPLC的核心部件，用于分离样品中的各组分。

色谱柱内部填充有固定相，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而实现分离。

4. 检测器：用于检测色谱柱流出的组分。

常见的检测器有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等，可根据不同物质的吸收、发射或电导特性进行检测。

5. 记录仪：用于记录检测器的信号，生成色谱图。

记录仪应具有高灵敏度和线性响应范围。

6. 进样器：用于将样品注入色谱柱。

进样器应具有微量进样功能，且进样操作简便、快速。

7. 数据处理系统：用于处理记录仪记录的信号，进行色谱峰识别、定量和定性分析等。

数据处理系统应具有强大的数据处理能力和友好的用户界面。

8. 废液收集器：用于收集色谱分离过程中产生的废液，确保实验环境的整洁和安全。

三、工作原理高效液相色谱仪的工作原理基于色谱分离原理。

在色谱分离中，流动相携带样品通过固定相，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，导致组分在两相之间的传递速度不同，从而实现各组分的分离。

在HPLC中，高压泵提供动力，推动流动相通过色谱柱，实现快速、高效的分离。

同时，检测器对分离后的组分进行检测，记录仪记录检测信号，最终由数据处理系统对色谱图进行分析和处理。

四、高效液相色谱仪的操作流程1. 准备工作：检查仪器各部件是否正常，确保流动相储存器、色谱柱、检测器等部件的连接完好。

高效液相色谱仪使用注意事项及工作原理高效液相色谱仪使用注意事项液相色谱仪在高效使用中需注意以下几个问题：1、色谱柱中的流动相是否会会排干的问题：不少做色谱分别试验的人碰到过这样的情形：不慎未适时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。

如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中全部流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，假如泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。

即使泵中充分了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。

由于泵只能输送液体，而不能输送空气。

2、色谱柱变干的问题：另一个更可能发生的情况是忘掉盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。

同样，整个色谱柱干枯的情况不太简单发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉全部溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。

即使色谱柱真的变干了，也不愿定就不可救药了。

可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。

较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应当能够溶解并去除滞留在填料中的气体。

色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。

3、使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意以下问题：假如常常需要更改流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会特别便利。

PEEK管路简单连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且简单调整锥箍之外的管路长度，便利与不同品牌或规格的色谱柱相连接。

使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。

虽然未察看到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK碰到上述溶剂会变脆。

另一个西药考虑的因素是压力限。

不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。

高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

I．概论 (3)一、液相色谱理论发展简况 (3)二、HPLC的特点和优点 (4)三、色谱法分类 (5)四、色谱分离原理 (5)II．基本概念和理论 (10)一、基本概念和术语 (10)二、塔板理论 (17)三、速率理论（又称随机模型理论） (19)III．HPLC系统 (22)一、输液泵 (23)二、进样器 (27)三、色谱柱 (29)四、检测器 (35)五、数据处理和计算机控制系统 (41)六、恒温装置 (42)IV．固定相和流动相 (43)一、基质（担体） (43)二、化学键合固定相 (46)三、流动相 (49)1．流动相的性质要求 (49)2．流动相的选择 (50)3．流动相的pH值 (51)4．流动相的脱气 (52)5．流动相的滤过 (53)6．流动相的贮存 (54)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (54)8．HPLC用水 (55)V．HPLC应用 (56)一、样品测定 (56)二、方法研究 (58)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (58)一、对起草单位的要求： (58)二、对复核单位的要求： (59)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

高效液相色谱的原理和应用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离技术，广泛应用于化学、制药、食品科学、环境监测等领域。

本文将介绍高效液相色谱的原理、仪器组成、常见模式、样品制备及其应用。

一、高效液相色谱原理高效液相色谱的原理是利用液相在不同固相填料上的吸附和分配现象，将化合物在不同填充柱中发生分离和纯化。

通常，HPLC 固定相含有一些化学基团，如反相和离子交换基团，可与样品中的化合物进行吸附和分配。

液相进样、柱温及流动相的组成等因素均会影响HPLC分离效果。

二、高效液相色谱仪器组成高效液相色谱仪的组成一般包括进样器、色谱柱、泵、检测器和处理系统等部分。

进样器将样品喷射到柱口，色谱柱用于灌流梳理样品，其中固定填料用于分离和分析所需的化合物。

泵用于将流动相推动柱中的样品，检测器观察所需分析的化合物是否沿着柱流动。

高效液相色谱不仅提供精确且迅速的色谱分离，而且对各种检测器兼容，可选择性地检测各种目标物。

三、高效液相色谱常见模式高效液相色谱常见的模式有反相、离子交换、正相等。

其中，反相色谱在所有柱中应用最广，其固定相通常是羟基烷基硅胶（C18）。

反相色谱的原理在于样品溶解于亲水性较低的溶剂中排出；在色谱柱中遇到亲水性较高的固定相时，由于样品亲水性性质，样品在固定相上发生反相互相作用来获得分离。

离子交换色谱是通过离子交换基团分离化合物中的阴阳离子的；正相色谱固定相仅仅地与正离子发生斥力作用，使分离物在某些环境下进行发生分离和净化，通常情况下正相色谱的相相反色谱。

不过在实际操作过程中，某些离子需要离子交换色谱柱才能实现的很好地分离。

四、样品制备高效液相色谱之前样品制备可能是个需要重视的选项，由于HPLC是在溶液环境中进行的，所以所需的样品必须适合在液相中溶解。

当涉及到样品之前显微技巧之后有必要进行物质氨基酸或肽的酸性或碱性水解，用于小分子化合物的样品溶剂通常为方法文献所标示的洗涤剂和/或过滤剂; 在使用纯度高的离子液体进行样品溶解和/或抑制和保护剂。

HPLC原理及基本操作HPLC（高效液相色谱法）是一种广泛应用于分析化学和制药工业中的分离技术。

它基于液相色谱法，通过将样品溶解在流动相中，并通过固定填料进行分离和分析。

1.样品的溶解：样品通常是固体或液体，在HPLC中需要将其溶解在流动相中。

流动相可以是水、有机溶剂或它们的混合物。

2.固定相填料的选择：HPLC中的填料通常是高度吸附性和具有大表面积的细小颗粒。

这些颗粒被填充在色谱柱中，提供了分离和分析的平台。

3.流动相选择：流动相的选择取决于样品的性质和目标分析的目的。

流动相的成分和配比可以根据需要进行调整，以改变分离效果和分辨率。

4.注射样品：将样品通过注射器引入HPLC系统，注射器将样品推入色谱柱中。

5.流动相的微量泵：流动相的微量泵非常重要，它通过控制流动相的流速将样品推过填料。

6.色谱分离：样品在填料中根据其亲水性（亲水性成分被保留在固定相上，疏水性成分则被推至溶剂流动相）进行分离。

固定相越亲水，则与样品中的亲水性成分相互作用越强；固定相越疏水，则与样品中的疏水性成分相互作用越强。

7.检测器：色谱柱的末端通常装有检测器，用于检测样品溶液中目标化合物的浓度。

8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，然后计算和解释结果。

HPLC基本操作：1.准备样品：将样品溶解在适当的溶剂中。

2.准备色谱柱：将填料装入色谱柱中，并使其适当压实。

3.连接色谱柱：将装有填料的色谱柱连接至HPLC系统。

4.设置流动相：根据需要设置流动相的组成和配比，通过微量泵提供流动相。

5.设置检测器：根据需要设置检测器，选择适合目标化合物的检测方法。

6.注射样品：使用自动或手动注射器将样品引入HPLC系统。

7.运行分析：通过微量泵控制流速，运行HPLC系统使样品通过色谱柱，分离和分析目标化合物。

8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，进行峰面积计算、峰高定量等数据处理。

9.结果解释：根据分析结果解释样品中的目标化合物的存在和浓度。

⾼效液相⾊谱法操作规程与注意事项⾼效液相⾊谱法操作规程与注意事项1.程序1.1.仪器及性能要求：所⽤的仪器为⾼效液相⾊谱仪，由泵系统，进样系统，⾊谱柱，检测器和⾊谱数据处理系统组成。

1.1.1.泵系统：HPLC泵系统通过⾼压⼒管和设备从溶剂瓶中吸取计量的流动相到柱⼦中。

现⾏的泵系统有⼀元或多元计算机控制的计量泵组成，这些泵可以按照梯度洗脱的要求改变流动相的⽐例或者是按等度洗脱的要求混合流动相。

1.1.2.进样系统：化合物被溶解在流动相或合适的溶剂中，可以通过⼿动进样器或定量环，或⾃动进样器转移到流动相中。

⾃动进样器由可存放进样瓶的卡盘组成，进样瓶的顶部有⼀个可以刺⼊的隔膜，进样针通过这个隔膜将样品转移到⼀个定量环中然后输送到⾊谱系统中。

1.1.3.⾊谱柱：最常⽤的⾊谱柱填充剂为化学键合硅胶。

反相⾊谱系统使⽤⾮极性填充剂，以⼗⼋烷基硅烷键合硅胶最为常⽤，⾟基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅胶和氨基键合硅胶）也有使⽤。

正相⾊谱系统使⽤极性填充剂，常⽤的填充剂有硅胶等。

离⼦交换⾊谱系统使⽤离⼦交换填充剂量；分⼦排阻⾊谱系统凝胶或系统⾼分⼦多孔微球等；对映异构体的分离通常使⽤⼿性柱。

除另有规定外，柱温为室温。

1.1.4.检测器：常⽤的检测器包括紫外分光检测器，⽰差折光检测器，⼆极管阵列检测器。

固定波长检测器在单⼀波长下运⾏，典型的波长是254nm，通过低压⼒的汞灯发射。

可变波长的检测器包含持续的能源，例如氘灯或⾼压⼒氙灯，通过单⾊器或⼲涉过滤器产⽣⼀定波长的单⾊光。

1.2.系统适⽤性试验1.2.1.为了确定最终运⾏系统的有效性，应当进⾏系统适⽤性试验。

整个系统可以⽤以下指标来评价：信噪⽐、理论塔板数，分离度，重复性，拖尾因⼦，其指标及计算⽅法应在相关分析⽅法中予以规定，如果没有专门的规定，按以下⽅法进⾏计算：信噪⽐：⽤于评价⾊谱系统检测微量物质的能⼒，美国药典的计算公式：S/N=2H/h，H为峰顶到基线的距离，h为基线中噪声峰最⼤值与最⼩值的差，该段基线需取≥5倍半峰⾼宽的距离，如果有可能，⽬标峰两侧取相等的距离（如图1）。

高效液相色谱法测定水体中的苯酚和α-萘酚一、实验目的1、了解色谱法的分离原理，初步学会使用高效液相色谱仪；2、利用高效液相色谱仪分离测定水体中的苯酚及α-萘酚。

二、实验原理1、色谱法的分离原理溶于流动相中的各待测组分经过色谱柱固定相时，由于各组分与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸收、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，达到分离的目的，又称色层法、层析法。

2、高效液相色谱仪使用原理高效液相色谱仪由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成四个系统即高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

正是根据物质的定性与定量关系，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。

3、苯酚及α-萘酚的分离原理及标准溶液准备对于一些组分比较简单的已知范围的混合物，或无已知物的情况下，可以利用保留值定性。

保留值的大小取决于分配系数之比，即与组分的性质、固定液的性质及柱温有关，与固定液的用量、柱长、流速及填充情况无关。

在一定操作条件下，用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积或峰高对对照品的量（或浓度）做校正曲线，求回归方程，然后在相同条件下分析试样，计算含量，这种方法称为校正曲线法。

通常截距近似为零，若截距较大，说明存在一定的系统误差。

本实验，苯酚的波长为270nm，α-萘酚的波长为295nm。

使得两种物质的吸收峰达最大值，最终选定在254nm条件下。

分别配置单样和混合液浓度为100mg/L、80mg/L、60mg/L、40 mg/L、20mg/L标准溶液，分别进样，记录保留时间和出峰面积，用于定性分析。