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高效液相色谱结果分析第二讲

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第2章 高效液相色谱分析法

第2章 高效液相色谱分析法

4. 选择流动相时应注意的几个问题
（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧 化铝固定相等。）
（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
信号采集/转换器
检测器
A泵
B泵
(2) 梯度洗脱装置
•利用两台高压输液泵，将两种 不同极性的溶剂按一定的比例送 入梯度混合室，混合后进入色谱 柱。
•可以根据设定的程序改变溶剂 配比，从而改变流动相的极性。
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
a. 准备状态：样品装入样品环，流动相不进入样品环； b. 进样状态：流动相流进样品环，将样品带入色谱柱。
液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型载体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。
（2）表面多孔型载体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的
(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
分离柱填充物的种类多样，分离机理各不相同，可将高 效液相色谱法分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化 学键合色谱法，离子交换色谱法等。（后面详细讲解）
(5) 液相色谱检测器
a. 紫外-可见光检测器 应用最广，有紫外-可见光吸收的有机化合物均可检测。 工作原理类似紫外-可见分光光度计，基于朗伯比尔定率： A=lg(1/T)=kc A -- 吸光度 c -- 样品浓度

高效液相色谱讲座Ⅱ高效液相色谱基本参数和基础理论(下)

高效液相色谱讲座Ⅱ高效液相色谱基本参数和基础理论(下)
讲
座
高效液相 色谱讲 座
高效液相色谱 基本参 数和基础理论 （ 下）
张玉奎 李秀珍＊ 卢佩章
（ 中国科学院大连化学物理研究所）
２ ５ 分离效能总指标—分离度 Ｋ和 Ｒ － １ １ ．定义：任何色谱过程的目的是要分
对两相邻峰， ｔ２ １） ／
ｔ２ １（＝ ｔ ，故 有 ／ ２ ／ １
离某一混合物中诸组分。混合物中各组分要
表２６ 柱长不同 － 时峰 容量与分析时 间的关 系 Ｈ ０ 米，ｕ 毫米／ Ｋ ＝１ １ ＝１微 ⒚ ＝１ 秒，１ ． ９
则必须用长柱子进行分离分析。
２７ 最佳操作条件的选择 －
１ ．保留值随冲洗剂组成变化规律 保留值变化规律是解决最佳条件选择和
色谱定性的基础。在二元体系的液 相色谱
中，目前有四种类型的方程：
其中 Ｓ为柱系统选择性指标
＋１ （－９ ６ ２４－）
图２ 给出了不同柱长时峰容量与分析时间 －７ 的关系曲线，表２ 列出由式（－９４所计 －５ ２４－ 算的保留时间随 值的变化。从表中可看出， 当 ＝ 时，出３个峰仅需６ １ ０ 分钟，而当 ＝ 由 Ｎ 为一常数，Ｋ１ 于 由分析精度的要求所 决定，因此对于欲分离的混合物中任一 “ 物
因子，Ｃ 是强溶剂Ｂ的 Ｂ
浓度。ａｂｃ分 别为各
方程的常数。方程 （－ ２ ５－ ０ １是由Ｓ ｙ ｅ 应用 ｎ ｄｒ 顶替吸附模型导出的液 固色谱保留方程。方程
（－０２是近似的溶解 ２５－）
度参数理论导出的保留
值方程。方程（－０３ ２５－）
是Ｓ ｏｔ ｃｔ 和Ｋｕｅａ在多 ｅｒ 层吸附模型基础上导出
ｌｇ Ｂ ａ ｂ Ｂ ｏｋＡ＝ － ｏ ｌ ｇＣ
表２５ － 峰保留时间随 值的变 化

《高效液相色谱》 (2)幻灯片

《高效液相色谱》 (2)幻灯片
液体固定相通过物理 吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
分配色谱–别离原理
不同组分在两相间分配系数不同
分配色谱固定相
固定相 --- 物理吸附 （担体 + 固定液）
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基 团 离子交换基团
中分子局部进入多孔中，一般保存 小分子完全进入多孔中，长时间保存。
排阻色谱固定相
1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物， 聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）
2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）
3. 高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球， 经化学键合处理，不随压力及溶剂改变 尺寸，（高效排阻色 谱）
离子交换色谱
分离原理
各种离子根据它们与树脂上的交换
基团的交换能力的不同而得到分离。
固定相
固定相为离子交换树脂， 流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。
分离对象 离子或可离解的化合物
（无机离子、氨基酸、蛋白质等）
排阻色谱法
(凝胶色谱法)
分离原理
根大据分样子品不分能子进尺入寸多大孔小中分，离不被保存，随 Vm流出
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所 组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰 基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正 相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱 体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相 是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲 醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。
O S SO ii HC O S lO i C H S l i3 ) ( 2 R CO H SO i Si3 ) ( 2 R CH

高效液相色谱分析法剖析课件

高效液相色谱分析法剖析课件
原理
通过高压泵将流动相（溶剂）泵入装有固定相（填料）的色 谱柱，当不同组分的混合物经过色谱柱时，由于在固定相和 流动相之间的分配系数不同，导致不同的组分以不同的速度 通过色谱柱，从而实现各组分的分离。
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
THANKS
感谢观看
03
土壤中农药残留分 析
高效液相色谱法能够检测土壤中 残留的农药成分，为土壤污染治 理提供依据。
生物样品分析
生物体内药物浓度测定
通过高效液相色谱法，可以测定生物 体内药物的浓度，有助于临床用药的
指导和疗效评估。
生物体内代谢产物分析
高效液相色谱法能够检测生物体在代 谢过程中产生的代谢产物，有助于了
解生物体的生理和生化过程。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
进样分析
样品进样
将处理好的样品按照规定的进样量注入色谱柱。
洗脱分离
通过流动相的洗脱作用，使待测物在色谱柱上分离成单个组分。
02
高效液相色谱系统的组成
色谱柱
01
02
03
功能
色谱柱是高效液相色谱系 统的核心部件，用于分离 样品中的不同组分。
类型
常用的色谱柱有硅胶、氧 化铝、活性炭、聚合物等 材质，根据不同的分离需 求选择合适的色谱柱。
性能指标
色谱柱的性能指标包括粒 径、孔径、柱长、柱内径 等，这些参数直接影响分 离效果和分离时间。

高效液相色谱结果分析-第二讲

高效液相色谱结果分析-第二讲

S=
x
i
- x
2
n -1
(3)相对标准(偏)差（RSD），也称变异系数(CV,有日内 变异与日间变异两种)
S RSD = 100 % x
5.检测限(limit of detection,LOD)

指在确定的实验条件下， HPLC 能检测出待测物的最低 浓度或含量。 ( 是限度检验效能指标，无需定量测定， 只要指出高于或低于该规定浓度即可).
7.专属性(specificity,或称选择性）

指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情 况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映 该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力， 是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量.
8. 线性（Linearity）
在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比关 系的程度。 线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率 （Slope）来表示。 数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系 数、y 截距（检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参 数，应列出回归方程数和线性图。
色谱峰的判断
最小面积
五.HPLC 测定 检测波长、柱温及进样量Ｓ等。 2.绘制标准工作曲线 3.精密度试验与回收率试验 4.实际样品含量测定
1.确定色谱条件 色谱柱的选择 流动相 流速 检测波长 柱温 进样量

2.绘制标准工作曲线
4.精密度(precision)

精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取 样测定所得结果之间的接近程度 ,表示测定的重现性。用 偏差（d）、标准偏差(SD )、相对标准偏差(RSD )(变异 系数，CV )表示. d=x x (1)偏差(d）： i测量值与平均值之差

《高效液相色谱分析》课件

《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成

仪器分析笔记--《高效液相色谱分析》-10页精选文档

仪器分析笔记--《高效液相色谱分析》-10页精选文档

第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。

目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。

B、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID和FPD检测器的HPLC。

C、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC与MS、NMR、IR联用的多维液相色谱法。

4、高效液相色谱法的特点①高压：采用高压输液设备，（150~350）×105Pa②高速：分析速度快；③高效：柱效很高。

（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g（UV）；10—11g （荧光检测）。

5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD、FID通用型检测器；③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离；④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa～1MPa压力。

§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。

现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：若将上式简化，可写作：这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。

H1、涡流扩散项ed：填料平均直径。

式中——λ：填充不规则因子；pd式中——C：常数；D：扩散系数；u：流动项的线速度。

H（1）固定相传质阻力项s式中——s C ：与k （容量因子）有关的系数；f d ：固定液厚度；s D ：扩散系数。

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范围的确定可因测定项目不同而有不同要求： 含量测定范围为80%-120%； 含量均匀度范围为70%-130%； 杂质测定应为被测杂质限度的50%-120%； 溶出度应为测定范围的±20%。
10.耐用性
指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度， 为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间 在正常情况下实验结果重现性的尺度。
半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点 作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间 的距离 .
峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值.
切线 半峰宽 切线峰宽
响应值
峰面积
色谱峰的判断 (最小面积)
时间
三.液相色谱图名词术语(3)
(2)非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出 能被可靠地检测出的最低浓度或量.
6.定量限(1imit of quantitation，LOQ)
指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一 定准确度和精密度要求。
(1)信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为10∶1 时相应的浓度或注入仪器的量进行确定. (2)按1984年国际纯粹和应用化学联合会(IVPAC)规定： 用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值， 再经试验确定方法的实际测定下限.
Fc: 流动相的流速 mL/min.
三.液相色谱图名词术语(5)
谱带扩展(Band Broadening): 由于纵向扩散,传质阻 力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象.
三.液相色谱图名词术语(6)
拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰. 前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰. 鬼峰(Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰,亦称假峰.
分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同 的实验者对同一样品的分别测试而获得的。(获得的这 种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的 耐用性,或称粗放度).
11.应用
(1)鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求. (2)杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外,其它都 不要求。 (3)杂质的含量测定除检测限外，其它都要求。 (4)含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都 要求。
5.检测限(limit of detection,LOD)
指在确定的实验条件下，HPLC能检测出待测物的最低浓 度或含量。(是限度检验效能指标，无需定量测定，只 要指出高于或低于该规定浓度即可).
(1)信噪比法 把已知低浓度试样测出的信号与空白样 品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低 浓度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1时的相应 浓度或量确定检测限。
检测器
记录仪
积分仪
色谱工作站
色谱仪信号输出图
数据处理原理
峰的检测 数据采集 基线校正和重叠峰的分离
数据处理方法
自动处理 人工修正
二.色谱图 (Chromatogram)
色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图, 其纵坐标为信号强度, 横坐标为时间
样品组分分离示意图
依 照 积 分 面 积 检 测 峰信号
切线 色谱峰的判断 最小面积
五.HPLC 测定步骤与内容
1.确定色谱条件: 色谱柱的选择，流动相、流速、 检测波长、柱温及进样量Ｓ等。
2.绘制标准工作曲线 3.精密度试验与回收率试验 4.实际样品含量测定
1.确定色谱条件
色谱柱的选择 流动相 流速 检测波长 柱温 进样量
Excellent t = 1.0 - 1.05
Acceptable t = 1.2
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线 波动.
结果处理与分析 第二部分
高效液相色谱
(High performance Liquid Chromatography，HPLC)
一、色谱数据处理 二、色谱图 三、色谱图名词术语 四、色谱峰检测 五、HPLC测定步骤与内容
一.色谱数据处理
色谱数据处理是通过ADC转换器,把模拟信号转换成数 字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。
三.色谱图名词术语(1)
色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响 应信号.
峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线. 峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离.
响应值 (mV)
←色谱峰
峰底 时间(分)
基线 ↓
峰高
三.色谱图名词术语(2)
切线峰宽(Peak Width, 峰宽):在峰两侧拐点处所作切 线与峰底相交两点之间的距离.
调整保留时间：tR’＝ tR－t0
三.液相色谱图名词术语(4)
保留体积(VR)(Retention volume): 组分从进样到出 现峰最大值所需的流动相体积.
死体积(V0)(Dead volume): 不被固定相滞留的组分, 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积.
调整保留体积：VR’＝VR－V0＝tR’ • FC
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变 化.
基线
基线噪音
基 线 飘 移
三.液相色谱图名词术语(8)
标准偏差(σ)(Standard deviation): 0.607倍峰
高处峰宽的一半，为便于测量，改用半峰宽。目的

是为了计算柱效率(柱效)。 柱效（理论塔板数） ：N＝
Rel. Int. (%)
100%
50%
0% 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 Time, min
Rel. Int. (%)
100%
50%
0% 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 Time, min
2.绘制标准工作曲线
标准曲线是定量分析的根本依据. 药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接 近的程度，用百分回收率表示。
4.精密度(precision)
精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取 样测定所得结果之间的接近程度,表示测定的重现性。用
偏差（d）、标准偏差(SD )、相对标准偏差(RSD )(变异 系数，CV )表示. (1)偏差(d）：
测量值与平均值之差
(2)标准(偏)差(SD或S）
(3)相对标准(偏)差（RSD），也称变异系数(CV,有日内 变异与日间变异两种)
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
回收率
M - 空白
R=
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价， 如高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率 （Slope）来表示。
数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系 数、y截距（检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参 数，应列出回归方程数和线性图。
9.范围（Range）
指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法 适用的高、低限浓度或量的区间。
7.专属性(specificity,或称选择性）
指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情 况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映 该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力， 是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量.
8. 线性（Linearity）
在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比关 系的程度。
保留时间(TR)(Retention time): 组分从进样到出峰最 大值所需的时间.
死时间(t0)(Dead time): 不被固定相滞留组分的出峰时 间.（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸 收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色 谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）.
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度, 应控制在100%左右(95%～105%)。
绝对回收率 模拟生物样品经整个样品处理过程,而相 应标准溶液直接分析,两者的响应值之比称为绝对回收 率。绝对回收率一般应大于70%,过低说明方法中待测 物质损失严重。
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试 验法”和“加样回收试验法”。

tR

2

或
2
N＝5.54
tR W1/ 2

标准偏差σ
进样
半峰宽
峰宽
塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡
图示中塔板数为3.
四.色谱峰检测
峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个 “阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采 用下面两种方式判别峰讯号的变化：
依 照 信 号 斜 率 的 变 化检测信号