狂犬病毒ELISA抗体检测试剂盒的初步应用

狂犬病毒（Ra）IgM 抗体检测试剂盒（酶联免疫法）使用说明（96T/48T）[原理]本试剂盒采用亲和素-生物素化Ra纯化抗原预包被板ELISA 原理，检测人血清/血浆中存在的狂犬病毒IgM 抗体，并配以酶标记抗人IgM单克隆抗体作为标记物。

加入底物TMB 显色后终止反应，在450nm波长测各孔O.D值，O.D值的大小与待检抗体含量成正比。

生物素系统（biotin-avidin system）的稳固级联放大作用，使试剂的特异性、灵敏度、稳定性极大地提高是本试剂含有的独特优点。

[用途]本试剂盒用于定性检测人血清/血浆中的狂犬病毒（RABIES VIRUS）IgM抗体，对因动物咬伤而致感染了狂犬病毒的诊断、流行病学调研和疫苗监测有重要意义。

适应范围：动物咬伤致狂犬病毒感染的诊断和监测。

[试剂盒组成]1、生物素化抗原预包被板1块（8X12/4X12）2、阴性对照1瓶（直接使用）3、阳性对照1瓶（直接使用）4、标本稀释液1瓶（20/10 ml，直接使用）5、酶结合物1瓶（12/5ml，直接使用）6、30X浓缩洗液1瓶（20/10ml，加蒸馏水1：30稀释使用）7、显示剂A、B液各1瓶（5/3ml）8、终止液（2M H2SO4）1瓶（5/3ml）9、说明书1份[操作步骤]1.将试剂盒平衡至室温后取出反应板拆封。

2.样本稀释：用标本稀释液以1∶101（5ul-500ul）稀释标本。

吸取已稀释待检标本100ul于反应孔中，设阴、阳性对照（各100ul/孔），设空白对照（加100ul标本稀释液）一孔，轻拍混匀，37℃温育30分钟，用洗涤液洗板3次并在吸水纸上拍干。

3.加酶结合物：每孔2滴，混匀后置37℃温育30分钟。

同上法洗涤3次并拍干。

4.显色：每孔加显色剂A、B各一滴，轻拍混匀（或震荡器混匀）后置37℃10分钟。

[结果判断]1.目测：在白色背景下观察各孔显色情况，蓝色者为阳性，无色者为阴性。

2.酶标仪测定：每孔加终止液一滴，混匀后在450nm下测定各孔O.D值。

应用ＥＬＩＳＡ方法检测犬狂犬病血清抗体试验摘要运用ELISA方法检测狂犬病抗体水平，试验结果表明：检测狂犬病抗体阳性率达92.5％，免疫效果基本满意。

运用此方法较简单、操作方便、灵敏度高、特意性强，值得推广运用。

同时，分析了免疫失效的原因。

关键词ELISA方法；狂犬病；血清抗体；检测狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患疾病，人和所有温血动物对狂犬病毒都易感，该病广泛分布于全世界，是一种自然疫源性疾病。

目前检测狂犬病血清抗体的方法有快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和小鼠中和试验（NIH）、间接免疫荧光试验、间接血凝试验等。

其中快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和小鼠中和试验（NIH）是OIE推荐的方法，但是这2种方法检测时间长，检测条件要求高，不适用于大规模的血清检测。

本试验运用ELISA方法检测了犬狂犬病抗体水平，现报告如下。

1材料与方法1.1 被检血清共40份，采自东莞市望牛墩镇免疫狂犬病疫苗至少30d以上的犬只。

1.2 试剂①狂犬病ELISA试剂盒，购自法国SYNBIOTICS公司，批号为6SRAB304，6SRAB305。

②狂犬病OIE标准血清，法国狂犬病OIE参考实验室提供。

1.3 方法（1）将OIE标准血清稀释7个稀释度，分别为1∶10、1∶30、1∶100、1∶150、1∶300、1∶1 000、1∶3 000，样品56 ℃灭活30 min后1∶10稀释。

（2）向每个酶标板微孔中加入90μL样品稀释液，然后分别加入10μL阴性和阳性质控、10μL稀释好的样品和10 μL OIE稀释血清（浓度从1∶10到1∶3 000）。

质控、样品和各浓度的OIE血清均做双孔。

37℃温育1h。

（3）用300 μL洗液洗4次，并在吸水纸上将检测板拍干。

（4）将酶标记物稀释液1∶10稀释酶标记物，向每个酶标板微孔中加入100 μL稀释的标记物。

37 ℃温育1h。

（5）重复（3）操作，加入100μL过氧化物酶底物，室温20 ℃温育30min。

狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。

一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。

现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。

关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。

RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。

脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。

据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。

尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。

中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。

检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。

下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。

1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。

电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。

病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。

犬狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒概述郁宏伟;张德宝;朱秀同;刘涛;石勇;何平有;赵玉龙【期刊名称】《中国动物保健》【年(卷),期】2017(019)004【摘要】在研究与分析我国近年来犬狂犬病流行情况、疫苗使用现状和市场需求等诸多因素的基础上,瑞普生物与浙江大学再次合作,成功研制出犬狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒-“锐清”。

该产品是农业部批准的三类新兽药【《新兽药注册证书》证号：（2016）新兽药证字71号】,已获得农业部核发的兽药生产批准文号【兽药生字030388829】,目前已成功上市。

【总页数】2页(P91-92)【作者】郁宏伟;张德宝;朱秀同;刘涛;石勇;何平有;赵玉龙【作者单位】瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定 071000;河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定 071000;瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定071000;河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定 071000;瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定 071000;河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定071000;瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定 071000;河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定 071000;瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定 071000;河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定 071000;瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定 071000;河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定071000;瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定 071000;河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定 071000【正文语种】中文【相关文献】1.狂犬病毒ELISA抗体检测试剂盒的初步应用 [J], 张德宝;朱秀同;刘涛;李艳莉;柳珊;何平有;郁宏伟;梁武2.两种猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒对疫苗免疫猪血清抗体检测的比较试验 [J], 张东东;宁宜宝;刘灿;龚文芝;徐璐;张玉杰;范学政3.犬狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用 [J], 廖园园;秦伟;李建;刘洁;曹娟;李晶梅;漆世华;于义娟;谢红玲4.6种狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的比对 [J], 王培; 雷琪莉; 邓柏林; 程汝佳; 韦海涛; 周德刚; 殷雨晴; 王跃; 沈光年5.国家三类新兽药狂犬病竞争ELISA抗体检测试剂盒 [J], 段鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人狂犬病病毒IgG抗体测定试剂盒（酶联免疫法）说明书1、产品名称通用名：人狂犬病病毒IgG抗体测定试剂盒（酶联免疫法）2、包装规格 96人/份3、预期用途：用于体外定性测定人血清中狂犬病毒IgG抗体。

人狂犬病疫苗免疫效果的临床检测中，应于暴露前0、7、21天全程接种人狂犬病疫苗14天后采血进行狂犬病病毒IgG抗体检测；或于暴露后0、3、7、14、30天全程接种人狂犬病疫苗14天后采血进行狂犬病病毒IgG抗体检测。

人狂犬病疫苗免疫后血清IgG抗体测定一般采用ELISA法或免疫荧光法。

4、检测原理本试剂盒采用间接ELISA法，以纯化狂犬病毒抗原包被，与抗人IgG单克隆抗体酶结合物等试剂组成，用于检测狂犬病疫苗免疫后人血清或血浆中IgG 抗体的IgG抗体。

5、主要组成成分抗原包被板：狂犬病毒抗原包被板 1块酶标工作液：小鼠抗人IgG单克隆抗体辣根过氧化物酶结合物 1瓶样品稀释液：小牛血清、吐温-20、PBS 1瓶阳性对照液：1:20稀释的狂犬病毒抗体阳性人血清 1瓶阴性对照液：1:20稀释的狂犬病毒抗体阴性人血清 1瓶20倍洗涤液：20倍浓缩的PBS-吐温-20 1瓶底物A: 过氧化氢 1瓶底物B： TMB 1瓶终止液：硫酸 1瓶6、储存条件及效期2-8℃避光保存，自检定合格之日起，有效期为2个月7、适用仪器洗板机：≥300ul酶标仪：波长应包含450nm和630nm恒温箱：37±0.5℃移液器：5-100ul8、样本要求试验样本应为新鲜采集，无污染、无溶血、无血脂的血清。

如不能及时检测，样本密闭置2-8℃保存，尽量不超过1周，以免影响检测结果；如冷冻长期保存，切勿反复冻融，冻融次数不超过2次。

9、检验方法9.1每次试验设阴性对照1孔，阳性对照1孔，以样品稀释液设空白1孔，每孔加相应液体100ul，在其余孔中加入样品稀释液，每孔100ul，再加入5ul 待检样品，振荡混匀后贴上封口膜，置37℃温育30分钟。

狂犬病的实验室检测与诊断技术武汉生物制品研究所基因工程室严家新研究员一、狂犬病实验室检测与诊断技术的用途1. 狂犬病人存活期内的实验室诊断：目前尚无实验室方法可确认处于潜伏期的狂犬病人。

对可能感染狂犬病毒而尚未发病（即处于潜伏期）的人应尽快接种狂犬病疫苗，必要时还要同时接种抗血清。

国外文献上比较可靠的研究结果已证明，狂犬病的潜伏期可能超过6年。

狂犬病疫苗在暴露后接种越快越好，但只要是在发病前，接种疫苗都会有保护作用，补种疫苗可以说没有时间限制。

狂犬病人一旦发病，其死亡率为100%。

病人在发病后最初几天，检测狂犬病毒的抗原一般是敏感的，常可在其唾液、角膜印片、尿液或皮肤中检出病毒抗原。

检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查。

但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。

皮肤活组织检查最好从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。

出现早期症状时检测抗原，仅有25-50%的患者为阳性；随着病情的进展阳性率也增加。

而脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后7—10天才出现。

但在国内护理条件下，狂犬病人发病后，很少能维持生命7天以上。

2. 动物和人狂犬病的死后诊断：可用抗原检测、病毒分离、病毒鉴定等方法进行死因确诊和病毒来源、演化分析。

3. 测定狂犬病毒的抗体:主要用于确定人或动物接种狂犬病疫苗是否成功。

W H O狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5 IU/ml的抗体水平表示免疫接种成功，能得到有效的保护。

前段时间国内因狂犬病疫苗假冒伪劣产品猖獗，而狂犬病疫苗的质量又是性命攸关的事，疫苗接种者主动要求在疫苗接种后测抗体的越来越多，这是可以理解的。

但只要疫苗的质量和供货渠道（包括保存条件）可靠，通常并不要求每个接种者都检测抗体。

因为除非接种者本身可能有免疫功能方面的异常，合格疫苗的抗体阳转率应为100%。

二、狂犬病的实验室检测与诊断的必要性典型的狂犬病的临床表现十分典型，但也有约40%的狂犬病例属瘫痪型，其表现并不典型，很容易与其他疾病混淆，所以实验室检测手段对狂犬病的确诊非常必要。

近几年，家庭饲养宠物的情况越来越普遍，为了研究兽用狂犬疫苗对犬的免疫效果，探索较为合理的免疫程序，我院于1996年1月至1998年10月，采用狂犬病毒ELISA抗体检测试剂盒（由卫生部兰州生物制品研究所提供），对佛山、南海、顺德的部分犬只抽取血清作抗体水平检测，现报告如下。

免疫效果观察一、材料狂犬抗体目试剂盒，卫生部兰州生物制品研究所生产，试剂盒内装备酶联免疫吸附试验（ELISA）全套试剂及标板（在有效期内使用）：1、酶标板为48孔，是狂犬病毒纯化抗原；2、样板稀释液，10ml3瓶装，用于稀释血清；3、阳性参考1瓶（5次试验量）已稀释，狂犬病毒抗体含量为0.1IUml；4、酶结合物1瓶（48犬份）5、底物液A、B各1瓶（48犬份）；6、洗液。

二、实验方法本实验采用间接ELISA法：1、给予免疫后20日左右待检犬只抽血0.5ml，分离血清，取10ml血清加样品稀释液0.49ml稀释为1：50，滴加100μI于酶标板各板孔，其中1孔为阳性对照，置37℃15分钟。

2、甩净孔中液体，用洗液冲洗八遍，甩净拍干，每孔加酶标记物一滴，置37℃15分钟。

3、甩净孔中液体，用洗液冲洗八遍，甩净拍干，每孔加入底物液A、B各1滴，置室温于10分钟内即可观察结果。

三、判定待检血清中，显蓝色者，达到或超过阳性参考孔，判为阳性或强阳性，抗体≥0.1IUml，符合免疫不平要求；不显争或显色低于阳性参考孔，判为阴性，应考虑加强免疫。

四、结果被检90只犬，均在第二次免疫后20天左右进行检测，结果有75只产生符合免疫水平要求的抗体；余下15只进行第三免疫，20天后检测，其中12只产生符合要求的抗体；余下的3只进行第四次免疫，均产生符合要求的抗体，见表1抗体水平有效保护期检测略。

一、方法对其中78只犬分别于120天、180天、360天采静脉血分离血清检测。

二、结果被检78只犬，120天均显阳性，符合免疫水平要求；180天有4只显阴性；360天有9只显阴性的，见表略2。

应用ELISA检测犬狂犬病抗体水平的探讨潘杰;周珊珊;蔡奕琪;曾庆泉【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2008(42)10【摘要】为了解应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测犬狂犬病抗体水平的效果,对东莞市采集的54份犬血清应用ELISA进行检测,采用Synbiotics软件进行分析,同时将该批血清送至军事医学科学院军事兽医研究所作荧光抗体病毒中和试验(FAVN)比较.ELISA检出阳性数35份,阳性率为64.82%,与军事医学科学院军事兽医研究所的测定结果差异不显著,符合率为85.19%.证明应用ELISA检测犬狂犬病抗体水平定性检测具有较高的准确率,适合在短时间内监测大批量的血清样品.【总页数】4页(P23-26)【作者】潘杰;周珊珊;蔡奕琪;曾庆泉【作者单位】东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞,523086;东莞市洪梅镇畜牧兽医站,广东东莞,523160;东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞,523086;东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞,523086【正文语种】中文【中图分类】S852.43【相关文献】1.检测犬源狂犬病毒中和抗体ELISA方法的建立 [J], 傅秋玲;郑佳琳;林颖仪;张莹;阳佑天;番姣姣;吴晓薇;郭霄峰2.应用ELISA方法检测犬狂犬病血清抗体试验 [J], 赖红青;何嘉仪3.犬狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒概述 [J], 郁宏伟;张德宝;朱秀同;刘涛;石勇;何平有;赵玉龙4.ELISA与FAVN方法检测犬狂犬病抗体的比较 [J], 孙招金;薛素强;刘晓慧;郭霄峰;郭慧霞5.犬狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用 [J], 廖园园;秦伟;李建;刘洁;曹娟;李晶梅;漆世华;于义娟;谢红玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

ELISA检测试剂盒使用指南ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测体内特定抗原或抗体的存在和浓度。

ELISA检测试剂盒是用于进行ELISA实验的组合套装，包括抗体或抗原、酶标记物、底物、缓冲液等。

本文将介绍ELISA检测试剂盒的使用指南，以帮助用户顺利进行ELISA实验。

1.准备实验材料：-ELISA检测试剂盒：根据实验需要选择适当的ELISA检测试剂盒，确保其在储存和运输过程中无损坏。

-样本：准备需要检测的样本，如血清、尿液、组织提取物等。

确保样本的质量和浓度满足实验要求。

-微孔板：根据试剂盒的要求选择合适的微孔板，同时注意其质量有无污染。

-基本实验设备：如计量器、洗板机、显微镜等。

2.实验步骤：-取出储存在4℃的试剂，确保其达到室温（一般为20-25℃），再根据实验步骤进行下一步操作。

-预处理样本：根据试剂盒的说明书，进行样本的预处理，包括稀释、纯化、稳定化等步骤。

-加样：将样本按照试剂盒要求的体积加入微孔板中，通常每个孔需要加入100-200μL的样品。

-洗板：使用洗板机或手工操作，将孔中的杂质洗净。

洗板时应注意洗涤缓冲液的使用浓度和洗涤次数。

-加入特异性抗体：根据试剂盒的说明书，将稀释好的特异性抗体加入各孔中，确保操作的准确性和每孔的稀释倍数。

-洗板：重复第4步的操作，将未结合的抗体洗净。

-加入酶标记物：根据试剂盒的说明书，将稀释好的酶标记物加入各孔中，确保加入的量准确无误。

-洗板：重复第4步的操作，将未结合的酶标记物洗净。

-加入底物：将稀释好的底物加入各孔中，使其与酶标记物反应，生成可视化的颜色。

-终止反应：根据试剂盒的要求，在一定的反应时间后，加入终止剂停止反应。

终止剂的选择需符合试剂盒的要求。

-检测结果：使用酶标仪或目视观察检测孔中的颜色变化，通过测量吸光度或颜色强度来确定样本中目标物的浓度。

3.数据分析：-计算样本的结果：根据试剂盒的说明书，根据吸光度或颜色强度测量结果，计算样本中目标物的浓度。

犬狂犬病毒抗体检测试剂盒使用说明书原理：本试剂盒采用酶联免疫方法（ELISA）检测犬血清中的特异性抗狂犬病毒抗体，用于全职面以后抗体监测。

试剂组成：1.预包被板48T/96T 8.终止液1支2.酶结合物原液2支9.临界对照品1支3.酶结合物稀释液2支10.阴性对照品1支4.洗涤液（PBST干粉）1/2支11.自封袋1个5.底物（3号液）1支12.使用说明书1份6.显色液（4号液）1支7.样本稀释液（5号液）1支操作程序：1.酶结合物工作液配制：取1支酶结合物原液全部加入到1支酶结合物稀释液中，充分混匀即可使用。

2.洗涤液配制：每袋PBST干粉用蒸馏水500ml溶解均匀，即为洗涤液。

3.加样反应：每滴孔加样品稀释液2滴，加待检样品各50ul。

每次试验需设阴性对照，临界对照各2孔，空白孔1孔，（阴性对照、临界对照已稀释，试验时可直接取100ul加入孔内，空白孔仅加2滴样品稀释液）。

放置37摄氏度20分钟。

倾去孔内液体，将已配制好的洗涤液加满每孔并静置30秒，倾去，甩干，共洗涤5次，拍干。

4.加酶反应：除空白对照孔外，其余每孔加已稀释的酶结合物2滴，置37摄氏度20分钟，然后如上洗涤。

5.显色反应：加底物（3号液）和显色剂（4号液）各1滴，混匀，37摄氏度下避光显色10分钟，加终止液（6号液）1滴，混匀，终止反应后判读结果。

结果判断：以空白对照调零，用酶标仪于450nm（630nm作参比波长）读取吸光度（A值）。

A值>=临界对照均值为阳性，说明待检样品的抗体滴度>=0.5IU/ml；低于者说明待检样品的当提浓度<0.5IU/ml。

注意事项：1.试剂盒于2—8摄氏度保存，有效期6个月。

每次使用前应先平衡至室温。

2.未使用完的板条应密封保存，已稀释的酶结合物工作液应尽快使用。

3.试剂盒中终止液具有腐蚀性，要小心使用。

4.瓶盖每次使用后要拧紧，各瓶盖之间不能混用。

不同批号试剂盒的试剂组分不可混用。