医学微生物学课件第22章病毒感染检查方法与防治原则

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病毒感染的检查方法及防治原则课件

分子生物学技术 PCR
Northern blot
中和试验
血凝抑制试验
补体结合试验免疫扩散等
病毒的血清学诊断
第二节病毒感染的防治
免疫预防
人工主动免疫灭活疫苗：乙脑疫苗狂犬疫苗流感灭活疫苗
HAV，HBV疫苗等减毒活疫苗：脊髓灰质炎疫苗麻疹疫苗
HAV疫苗腮腺炎疫苗风疹疫苗
亚单位疫苗：
病毒感染的检查方法及防治原则
法方养培大三
2、常规分离与鉴定动物接种鸡胚接种组织培养器官培养移植培养原代细胞培养细胞培养二倍体细胞培养传代细胞培养
1、CPE
病毒在细胞内增殖的指标
ห้องสมุดไป่ตู้
正常细胞病变细胞
2、红细胞吸附
光镜-----包涵体电镜免疫荧光
病毒的快速诊断
ELISA
Southern blot 杂交
药物防治
金刚烷胺-------抑制病毒脱壳-----预防感冒
RNA或DNA类似物 ------治疗疱疹性脑炎等疱疹病毒感染
阿糖腺苷类、无环鸟苷、二羟丙氨甲基鸟嘌呤迭氮酰氨胸苷
抑制人类 HIV 逆转录作用
治疗AIDS
干扰素干扰素诱生剂
中草药

临床医学微生物学PPT-病毒感染的检查方法与防治原则课件

第一节病毒感染的检查方法
二、病毒形态学检查 • 光学显微镜-----CPE、包涵体 • 电子显微镜-----病毒颗粒
第一节病毒感染的检查方法
1、病毒抗原的检测
检测病毒成分
（1）IFA和IHC：通常是已知抗体去检测抗原；（2）反向被动血凝试验；（3）对流免疫电泳；（4）放射免疫测定法；（5）ELISA；（6）时间分辨荧光测量技术；（7）斑点-酶免疫与Western blot；
1、病毒抗体的种类：IgG、IgM、IgA和IgE。
2、检测抗体的方法
（1）中和试验：特异性的抗病毒免疫血清（中和抗体）
与病毒作用，能抑制病毒对敏感细胞的吸附、穿入，从
而阻止病毒的增殖，使其失去感染力。
（2）血凝抑制试验
（3）补体结合试验
（4）间接血凝试验（5）乳胶凝集试验
检测病毒抗体
（6）ELISA
HIV人工合成受体竞争抑制病毒的吸附 Fig A) HIV attach to a CD4 receptor. B) A soluble synthetic version of the receptor can prevent attachment of the virus.
本章要点
1．标本的采集与送检 2．病毒分离培养的方法与细胞病变效应（CPE）
第一节病毒感染的检查方法
病毒蛋白
病毒的快速诊断
免疫荧光
ELISA 病毒核酸
Southern blot 杂交 Northern blot PCR
第一节病毒感染的检查方法
中和试验
血凝抑制试验
补体结合试验免疫扩散
病毒的血清学诊断（检测病毒抗体）
第二节27章病病毒毒感感染染的的防治防治原则

医学微生物学：病毒感染的检查方法与防治原则

病毒感染的检查方法与防治原则
第一节病毒感染的检查方法
一、标本采集与送检
原则：与细菌类似 •用于分离培养的标本：采取采取急性期标本、使用抗生素处理防细菌污染
无菌操作、低温保存、尽快送检
•血清学诊断的标本：双份血清？
早期采集
标本的采集和送检六原则
无菌采集采集合适的标本
采集双份血清
尽快送检正确标记
❖ 种类：常用的传代细胞有HeLa（宫颈癌）细胞、KB（口腔癌）细胞、HEp-2（喉癌）细胞、Vero（非洲绿猴肾）细胞等。
❖ 特点及作用：由于传代细胞系能有规律地持续传代，容
易保存（-70℃~-196℃）且对某些病毒易感，因此，在
诊断、科研等非疫苗生产的项目中常被采用。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用传代细胞系
病毒1:100稀释
病毒1:1000稀释
中性红染色：活细胞呈红色，受病毒感染破坏的细胞不着色
三、病毒感染的诊断
1.病毒形态学检查 2.病毒成分（病毒蛋白和核酸）检查 3.病毒感染的血清学（病毒抗体）检查
❖ 标本类型？与细菌标本类似 ❖ 好的标本？正常无菌性体液 ❖ 标本内容物一般需要含有宿主细胞
二、病毒的分离培养与鉴定
病毒的实验室诊断方法
动物接种
病毒
鸡胚培养
分离培养方法（金标准）
检细胞培养测病毒成分检测
活细胞
血清学诊断
（一）病毒的分离培养
1.动物接种
❖ 最原始的病毒培养方法多用于没有敏感细胞进行细胞培养的病毒（乙肝、丙肝、丁肝、戊肝病毒等）
二倍体细胞培养(diploid cell culture )

[医学微生物学]病毒感染的检查方法和防治原则

③CPE：形成包涵体（inclusion body）
⑵ 红细胞吸附（hemadsorption, HAd）
受染细胞膜表面血凝素（HA）＋ RBC表面HA受体
Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet.
①原代培养细胞（primary cultural cells)
epithelial cells
①原代培养细胞（primary cultural cells) 特点:
◙ 对多种病毒敏感
◙ 生长能力有限, 获取成本高 ◙ 可携带潜伏病毒应用: ◙ 病毒分离与鉴定 ◙ 病毒学实验研究 ◙ 不能用于制备疫苗
(3) 细胞培养(cell culture)
根据细胞来源、染色体特征及传代次数分: 原代培养细胞二倍体细胞株传代细胞系或株
①原代培养细胞（primary cultural cells)
剪碎组织
蛋白酶培养基组织块分散的单个细胞单层细胞
(原代细胞)
单层细胞传代培养
(次代细胞)
Allantoic inoculation is done mainly for production of vaccine of influenza virus.
主要用于流感病毒疫苗的生产
Poxvirus inoculate in allantoic membrane 痘病毒绒膜尿囊膜接种
Viral replication produces visible lesions (pocks), grey-white area in the transparent(透明的) allantoic(尿囊的) membrane.

病毒感染实验室诊断与防治原则课件

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1.病毒感染实验室诊断
• 病毒在培养细胞内增殖的检查与鉴定 ①细胞病变效应(CPE)：一些病毒增殖后引起细胞折
光性下降、圆缩或肿胀、聚集或融合、脱落和死亡。
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1.病毒感染实验室诊断
②红细胞吸附：流感病毒和某些副粘病毒感染细胞膜上可出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡及人红细胞。抗血清或抗体可抑制红细胞吸附现象发生，称为红细胞吸附抑制试验，可作为此类病毒增殖及初步鉴定指标。腮腺炎病毒感染细胞吸附红细胞
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2.病毒感染防治原则
▲干扰素和干扰素诱生剂：①干扰素：主要用于乙型和丙型肝炎病毒、人呼吸道合胞病毒等感染的治疗；②干扰素诱生剂：如Poly I:C等。
▲中草药：板兰根、穿心莲、大青叶、金银花、黄芩等中草药对病毒性疾病有预防或治疗作用。
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本章要点
• 病毒感染标本采集与送检注意事项。 • 病毒分离培养方法、增殖指标及细胞病变效应。 • 简述病毒感染快速诊断方法。 • 预防病毒感染人工主动自动免疫制剂
▲荧光显微镜检查：荧光标记抗体染色镜检，常用。
▲透射电镜检查：很少用。
狂
A
B
犬
病
毒
内
基
小
体
A：正常细胞；B：病毒感染细胞
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1.病毒感染实验室诊断
• 病毒分离培养：细胞培养、鸡胚接种、动物接种法。 ▲细胞培养法：原代、二倍体、传代细胞培养，不同病
毒选择不同细胞进行分离培养。
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段，具有高通量、高敏感性和特异性等优点。
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1.病毒感染实验室诊断

病毒学病毒感染的检查方法和防治原则讲义

• 医学微生物学（第9版）
三、病毒感染的诊断
（一）形态学检查
1. 电镜和免疫电镜检查：病毒形态和大小
（李凡主编的第 8 版医学微生物学图 27-1，258 页）
• 医学微生物学（第9版）
三、病毒感染的诊断
（一）形态学检查
2. 光学显微镜检查：病毒形成的包涵体、合胞体等
（李凡主编的第 8 版医学微生物学图 33-2，314 页）
（二）病毒的鉴定
二、病毒的分离与鉴定
1. 病毒感染的常用鉴定方法
（2）病毒血清学鉴定：用已知特异性抗体对病毒进行种、型和亚型的鉴定
• 医学微生物学（第9版）
（二）病毒的鉴定
二、病毒的分离与鉴定
1. 病毒感染的常用鉴定方法
（3）病毒分子生物学鉴定：对病毒的蛋白抗原和核酸进行检测，方法包括蛋白印迹技术、核酸扩增、核酸杂交、基因芯片和基因测序等
• 医学微生物学（第9版）
• 医学微生物学（第9版）
三、病毒感染的诊断
（二）病毒成分检测
1. 病毒蛋白抗原检测用已知特异性抗体对病毒抗原进行早期诊断，常用方法酶免疫测定
（enzyme immunoassay，EIA）、免疫荧光测定（immunofluorescence assay，IFA）、蛋白印迹（Western blot）
• 医学微生物学（第9版）
二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒的分离培养
1. 动物接种
（1）应用：无敏感细胞培养的病毒（2）优点：结果易观察，可建立动物模型（3）缺点：要有饲养条件，费用高，可能有潜伏病毒，对许多人类病毒不敏感
• 医学微生物学（第9版）
二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒的分离培养

病毒感染的检查方法与防治原则

风疹病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE（－）埃可病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE（＋）
风疹病毒？＋人胚肾细胞
埃可病毒
CPE(-)——埃可病毒(-) 风疹病毒(+)
CPE(+)——埃可病毒(+) 风疹病毒(-)
4. 病毒的分离培养与鉴定
◙ 病毒的分离培养 ◙ 病毒: 的鉴定 ◙ 病毒数量及感染性测定
50%组织细胞感染量(TCID50)
分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释度的HCMV感染的HEL细胞
SARS冠状病毒的分离和鉴定
香港大学专家：患者鼻咽标本→Vero细胞培养 →CPE →EM观察：冠状病毒
随后加拿大和美国CDC等SARS国际协作组的多个实验室也培养出了冠状病毒
2. 分离病毒的标本和作血清学诊断的标本各有何要求？ 3. 常用的分离培养病毒的方法有哪些？各有何应用？ 4. 病毒在组织细胞中增殖的指标是什么？ 5. 病毒性感染的快速诊断方法有哪些？
受染细胞膜表面血凝素（HA）＋ RBC表面HA受体
Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet.
⑶ 干扰现象（interference）
光学显微镜：可观察大病毒（痘病毒）和包涵体对一般病毒检测意义不大
Electronmicrographs
呼肠病毒感染回肠上皮细胞电镜照片
Inclusion body
Negry body
Cytomegalic cell that contains a dense, "owl's eye," acidophilic intranuclear inclusion body

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医学微生物学
（二）检测病毒蛋白抗原
用已知特异性抗体直接检测病毒蛋白抗原（简便、敏感、特异）
常用方法：免疫荧光技术（IF）固相放射免疫测定（SPRIT）酶免疫技术（EIA）等。
• 红细胞吸附 • 干扰现象 • 细胞代谢改变（pH）
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正常细胞
2020/5/3
病变细胞
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（二）病毒的鉴定
核酸类型、理化性状、形态、血清学鉴定、基因测序和生物对比。
（三）病毒的数量与感染性测定 1.50％组织细胞感染量 2.红细胞凝集试验 3.空斑形成试验
பைடு நூலகம்
2020/5/3
2020/5/3
医学微生物学
第二节病毒感染的特异性预防
一、人工主动免疫 1、灭活疫苗 2、活疫苗 3、重组载体疫苗 4、亚单位疫苗二、人工被动免疫 1、免疫球蛋白 2、细胞免疫制剂
2020/5/3
医学微生物学
第三节病毒感染的治疗
• 药物治疗
– 核苷类药物——抑制病毒基因复制 ——抑制病毒基因转录
医学微生物学
三、病毒感染的血清学诊断
用已知病毒抗原检测病人血清中相应抗体以诊断病毒性疾病（中和实验、补体结合实验、血凝抑制实验、凝胶免疫扩散等）
2020/5/3
医学微生物学
四、病毒感染的快速诊断
(一) 形态学电镜和免疫电镜——直接观察病毒光镜—— 大病毒和包涵体
2020/5/3
医学微生物学
（1）原代细胞—来源于动物、鸡胚、人胚组织细胞，对多种病毒敏感，但只能传2-3代。
（2）二倍体细胞—在体外分裂50-100代后仍保持2倍体染色体数目的单层细胞。
（3）传代细胞—能在体外无限传代的细胞多由癌细胞或二倍体细胞突变而来。
2020/5/3
医学微生物学
病毒在培养细胞中增殖的指标
• 细胞病变效应（CPE）：即某些病毒在细胞内增殖引起的特有的细胞病变（细胞变圆、聚集、坏死、脱落等）
2020/5/3
医学微生物学
二、病毒的分离培养与鉴定（virus isolation and determination）
（一）病毒的分离培养
• 动物接种选择易感动物及接种部位，观察发病情况
• 鸡胚培养不同病毒选择不同接种部位（绒毛尿囊膜，尿囊腔，羊膜腔，卵黄囊），分离流感病毒最常用。
• 细胞培养：分离病毒最常用的方法
2 核酸扩增
– 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR DNA）
– 连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR） – 反转录PCR（Reverse transcrptase PCR，RT—PCR
(RNA)
3 基因芯片技术（gene chip）
2020/5/3
医学微生物学
（三）检测病毒特异性IgM抗体
检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染或证明病毒复制。
2020/5/3
医学微生物学
（四）检测病毒核酸
1 核酸杂交
– 斑点杂交（dot hybridization） – 原位杂交（in site hybridization） – DNA印迹杂交（Southern blot） – RNA印迹杂交（northern blot）
第22章病毒感染的检查方法与防治原则
2020/5/3
医学微生物学
第一节病毒感染的检查方法
一标本的采集与送检（ principle of collection specimen）
1、采集急性期标本 2 、污染标本应用抗生素抑制标本中细菌或真菌的生长 3 、低温保存，快速送检 4、血清学实验检查抗体（双分血清）
– 蛋白酶抑制剂 – 天然药物（中草药） – 其他药物（金刚烷胺）
• 干扰素及干扰素诱生剂治疗 • 基因治疗（反义寡核苷酸、抑制病毒复制） • 免疫治疗（特异性抗体、免疫调节剂、治疗性疫
苗等
2020/5/3
医学微生物学