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微卫星荧光标记分析坝上长尾鸡与3个地方品种鸡遗传多样性关学敏;耿立英;贺英;李祥龙【期刊名称】《中国畜牧杂志》【年(卷),期】2015(51)19【摘要】为评估坝上长尾鸡保种群的遗传结构和其他地方品种鸡的遗传关系,本研究利用20个微卫星DNA标记,采用微卫星荧光标记与毛细管电泳相结合的方法,检测了4个地方鸡品种共120个个体的遗传多样性.结果表明:20个微卫星位点中有19个微卫星位点均为高度多态,120个个体中共检测到253个等位基因,单个位点的等位基因数从4 (MCW0103)～27 (LEI0094)不等,平均为12.65.所有位点的平均期望杂合度和平均多态信息含量分别为0.697 5和0.673 6;所有群体均显示较高的期望杂合度,坝上长尾鸡最高,为0.747 2,太行鸡相对比较低,为0.698 0,平均遗传分化系数为0.098,群体内的近交系数为20.4％,杂合子缺失的水平不高;群体的Nei's 遗传距离从0.059 7(广西麻鸡-太行鸡)～0.689 0(北京油鸡-太行鸡)不等.UPGMA 系统发生树中,广西麻鸡和太行鸡聚为一类,然后又于坝上长尾鸡聚在一起.北京油鸡独自聚为一类.UPGMA系统发育树结果与这些鸡品种的外貌形态相吻合.【总页数】4页(P13-16)【作者】关学敏;耿立英;贺英;李祥龙【作者单位】河北科技师范学院,河北秦皇岛066004;河北科技师范学院,河北秦皇岛066004;河北科技师范学院,河北秦皇岛066004;河北科技师范学院,河北秦皇岛066004【正文语种】中文【中图分类】S831.2【相关文献】1.用微卫星标记分析四品系(群)矮脚鸡的遗传多样性 [J], 张福平;傅筑荫;陈彬;吴志国2.利用微卫星标记分析边鸡遗传多样性及保种效果 [J], 张跟喜;丁馥香;王金玉;李源;张李俊;王伟;周胜花;张丽3.坝上长尾鸡保种群遗传多样性和保种效果评价 [J], 关学敏;耿立英;贺英;李祥龙4.利用微卫星标记分析儋州鸡等5个地方种群遗传多样性 [J], 李义书;刘祎;侯冠彧;曹婷;周汉林;施力光;蔡克奇5.利用微卫星标记和线粒体mtDNA D-loop区分析龙胜凤鸡遗传多样性 [J], 黄英飞;莫国东;吴强;孙俊丽;周志扬;万火福;韦凤英;廖玉英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
第39卷第
6期
2021年12月
陕西科技大学学报Journal of Shaanxi University of
Science
& Technology
Vol. 39
No.
6
Dec. 2021
文章编号：
2096-398X(
2021 )
06-0058-07
鹿药抗真菌有效部位筛选及其作用机制研究刘 伟
】，赵然然】，
张梦莎
】，罗凯英】，庞廷松】，
赵鹏帅2,周翼鹏
2
(.陕西科技大学食品与生物工程学院药学系，陕西西安710021； 2.空军军医大学药学院药化和药分教 研室,陕西西安
710032)
摘 要：
旨在筛选鹿药抗真菌的有效部位，初步探讨鹿药抗真菌有效部位的作用机制
.首先采
用75%乙醇加热回流提取与石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取相结合的方法对鹿药进行提取 分离制备鹿药正丁醇萃取物、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水萃取部位，通过微量液基
稀释法、生长实验、时间-杀菌曲线实验、生物被膜实验、棋盘式微量液基稀释法等考察鹿药不 同萃取部位的抗真菌和抗生物被膜活性，CCK8
法考察鹿药部位的细胞毒性，并采用点板实验
和激光共聚焦显微镜初步研究鹿药部位对真菌细胞壁的作用.结果发现鹿药的正丁醇部位具
有良好的抗真菌和抗生物被膜活性，MIC值范围为104
〜832
毺g/mL,其抗真菌活性浓度低于
细胞毒性浓度.此外，鹿药的正丁醇部位与两性霉素B或阿尼芬净联用具有协同抗真菌活性. 初步机制研究显示鹿药正丁醇作用后的真菌对细胞壁抑制剂和两性霉素B敏感性增加，且会 引起真菌几丁质含量增加.因此，鹿药的正丁醇部位可能是其抗真菌的有效部位，其抗真菌活
性可能与影响细胞壁尤其是增加几丁质含量有关.关键词：
鹿药；
抗真菌；抗生物被膜；有效部位；
作用机制
中图分类号:R978. 5 文献标志码:
A
Active fraction selection of Smiladna japonica A. Gray
and its antifungal mechanisms
黑龙江省哈尔滨市苜蓿镰孢根腐病病原菌分离鉴定朱月，任乃芃，唐佳琳，刘香萍*（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）摘要：【目的】明确黑龙江省哈尔滨市苜蓿根腐病病原菌种类。
【方法】采集38株黑龙江省哈尔滨市农业科学院示范区的苜蓿根腐病病株，经组织分离法分离致病菌，通过科赫氏法则验证其致病性并结合形态学和rDNA-ITS序列分析鉴定病原菌。
【结果】从患有苜蓿根腐病的病根分离并选取具有代表性的5株真菌KY1、J1、S1、SA1、C1，分别被鉴定为腐皮镰孢（Fusarium solani）、尖镰孢（F.oxyspo⁃rum）、水稻恶苗病菌（F.fujikuroi）、三线镰孢（F.tricinctum）和层出镰孢（Fusariumproliferatum）。
致病性测定表明5株真菌均为苜蓿根腐病致病菌。
【结论】腐皮镰孢不仅分离率最高，为57.45%，且致病性也较强，病情指数为61.00，是优势病原菌。
关键词：苜蓿；根腐病；腐皮镰孢；鉴定；致病性中图分类号：S541+.1 文献标志码：A 文章编号：1009-5500（2023）02-0099-08DOI：10.13817/ki.cyycp.2023.02.012紫花苜蓿（Medicago sativa）是优质多年生豆科牧草，在世界范围内栽培最早、分布面积最广，适应性强，营养价值高，有“牧草之王”的美誉［1-3］。
苜蓿作为我国主要优质牧草之一，对畜牧业发展尤为重要［4-5］。
近年来，国内苜蓿在所有栽培牧草中的地位日渐凸显，其种植面积逐渐扩大［6］。
随着苜蓿集约化程度不断提高，苜蓿病害的发生日趋严重［4-5］，其中根腐病已成为苜蓿单产下降和植株衰败的一个极其重要的因素［7-8］，该病一旦大面积发生会严重降低苜蓿产量，甚至需要重新建植，严重阻碍苜蓿大面积推广［9］。
根腐病是世界性病害，在国内外的各个苜蓿栽培区普遍发生，全世界每年由根腐病造成的产量损失在20%左右，有些发生严重的地块甚至达到40%［10-12］。
植株问密度的调节。
３．１．２实验材料的采集及样本处理样本的采集以建园无性系为单位，每个无性系采集一个单株，另外考虑到松类针叶中所含的多糖和次生代谢物（如酚，脂、菇等）会影响到ＤＮＡ的提取质量，本试验选择的采集部位为当年新抽的嫩梢（２００４年３月采集），约３～６∞长，每个无性系视嫩梢长度采集６～８条来代表该无性系基因型，共采集４９个无性系。
同时，根据无性系在种子园内分布的情况，于２００４年１０月分别选出三棵无性系单株作为采种母树。
１６＃无性系作为采种母树的单株位于１大区２０小区、２２＃无性系作为采种母树的单株位于１大区２０小区、４１＃无性系作为采种母树的单株位于１大区１９小区，分别从这三棵母树上采集球果若干。
将从三株母树上得到的种子分别按无性系置于培养皿中蒸馏水至少浸泡４８个小时，然后摆放在发芽盒内，２５℃光照培养箱中发芽，每天补水。
当幼苗长到大约５～６ｃｍ时取出，去除种壳和残余胚乳，将整株幼苗放入．７０＂（２冰箱中保存。
用种子发芽得到的整株幼苗（去除种壳和残余胚乳）中提取的ＤＮＡ来代表子代基因型。
三棵母树的种子幼苗代表子代群体。
图１无性系种子ＦｉｇＡＣｌｏｎａｌｓｅｅｄｓ图３种子发芽２Ｆｉｇ．３Ｓｅｅｄｓｓｐｒｏｕｔｉｎｇ（２）图２种子发芽１Ｆｉｇ．２Ｓｅｅｄｓｓｐｒｏｕｔｉｎｇ（１）圈４畸形苗（１、２）和正常苗（３，４）Ｆｉｇ．４Ｍｏｎｓｔｅｒｓｅｃｄｉｎｇｓ‘１．２）ａｎｄｎｏｒｍａｌｓｅｅｄｉｎｇｓ（３．４）３．２试验方法３．２．１ＤＭ的提取针对不同的材料分别用两种方法提取ＤＮＡ：胚乳ＤＮＡ的提取采用ＳＤＳ法；嫩梢及整株幼苗总ＤＮＡ的提取采用最简单的ＣＴＡＢ法。
擅越璧蕴趁苣旦△丝数理亟Ｉ．将约Ｏ．２９材料放入１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，将塑料研磨棒插入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管＂（压紧植物材料），放入液氮中约１分钟；２．迅速研磨后，加入约５００１．ｔ１的１．５％ＣＴＡＢ提取缓冲液（７５ｍＭＴｆｉｓ．ＨＣＩ（ｐＨ８．Ｏ）。
本技术公开了大麻哈鱼的微卫星分子标记位点及多态性引物和应用。
本技术从大麻哈鱼基因组DNA中筛选出10个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获得引物的扩增结果具有多态性和稳定性，可适用于大麻哈鱼亲缘关系鉴定，种群遗传多样性检测，以及分子辅助育种领域。
权利要求书1.大麻哈鱼微卫星分子标记位点的序列，其特征在于，该序列为SEQ ID：1-10。
2.如权利要求1所述微卫星分子标记位点序列，其特征在于，该微卫星分子标记位点两端的侧翼序列上设计的引物序列为SEQ ID：11-30。
3.权利要求2所述的引物序列SEQ ID：11-30的筛选方法，其特征在于，该筛选方法基于全基因组的简化基因组测序后进行多态性筛选。
4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法具体为：先用酶切法建库，然后进行测序，对读到的序列进行微卫星分析，先选出微卫星重复单元比较多的序列，再对比基因组文库筛选得到了多个微卫星分子标记位点，并根据相关位点，设计引物并予以合成；再在大麻哈鱼多个个体中进行PCR扩增验证，筛选出扩增产物正确的引物对，再对产物正确的引物对进行筛选，最终从中筛选出10对多态性良好的微卫星引物序列SEQ ID：11-30。
5.权利要求1所述的微卫星分子标记位点序列SEQ ID：1-10在大麻哈鱼亲缘鉴定中的应用。
6.权利要求2所述的引物序列SEQ ID：11-30在大麻哈鱼亲缘鉴定中的应用。
7.如权利要求7所述的应用，其特征在于，该应用的具体亲缘鉴定方法包括以下步骤：1)样品基因组DNA提取；2)荧光引物合成：对得到的10对引物序列SEQ ID：11-30进行荧光引物合成；3）PCR扩增，产物分析检测；4）对上述检测数据分析，计算等位基因、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量，多态性分析鉴定亲缘关系。
技术说明书大麻哈鱼微卫星分子标记位点及多态性引物和应用技术领域本技术属于分子生物学DNA分子标记技术领域，具体涉及大麻哈鱼微卫星分子标记的开发技术。
大仓鼠SSR座位的筛选及黑线仓鼠MHC基因的克隆与序列分析大仓鼠(Tscherskia triton)和黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)在我国分布范围广,繁殖力极强,是危害农业、传播疾病的有害动物,因此本论文主要针对这两类害鼠展开分子生物学方面的研究。
微卫星是一种较好的分子遗传标记,在种群进化研究、种群结构分析、遗传多样性等研究中得到了广泛的应用。
大仓鼠(Tscherskia triton)是广泛分布于我国长江以北的重要害鼠之一。
过去关于大仓鼠微卫星座位的筛选、利用其进行遗传多样性研究的报道较少。
研究一使用经典的酚/氯仿抽提法从保存于-70℃的肝脏组织中提纯北京顺义、河北固安、饶阳等地区大仓鼠的基因组DNA,并利用大仓鼠近缘种—原仓鼠(Cricetus cricetus)、金仓鼠(Mesocricetus auratus)和黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)的10对微卫星引物(LOC-1至LOC-6;SSR1至ssrf11),通过PCR扩增筛选大仓鼠的微卫星座位,并对可能含有微卫星的阳性克隆进行测序,最终得到33个微卫星序列。
利用BLAST序列分析软件对GenBank数据库进行检索,没有找到同源性一致的相应微卫星序列,表明33个大仓鼠微卫星序列都是首次发现的。
注册序列的GenBank登陆号为EF690673～EF690693,EU140825～EU140836。
这些微卫星序列可以分成三类:完美型占39.4%,非完美型占24.2%,复合型占36.4%。
另外可见重复次数在8～20的微卫星序列最多,占60.6%,重复次数在21次以上的占39.4%。
大部分微卫星序列的二核苷酸重复次数均在12以上,可以进行后续大仓鼠微卫星引物设计和相应的种群多态性分析。
主要组织相容性复合体(MHC)是由紧密连锁、高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个区域,MHC基因具有高度多态性,对于维持种属的生存与延续具有重要的生物学意义。
大兴安岭北部山地雪兔冬季生境选择刁钦尽;鞠丹;任梦非【期刊名称】《黑龙江科技信息》【年(卷),期】2016(000)013【摘要】2014和2015年冬季，在大兴安岭图强林业局奋斗林场，利用布设样线的方法对雪兔生境选择进行了研究。
通过生境选择指数分析表明，雪兔主要选择在中坡位、阳坡、坡度小于25度、离人为干扰距离大于1000M的针阔混交林和灌丛生境；主成分分析表明，隐蔽条件、食物、温度和人为干扰是影响雪兔生境选择的主要因子。
%Winter of 2014 and 2015 in the greater hinggan mountains struggle hard forestry administration forest farm, by using the method of setting sample line of snow rabbit habitat selection is studied. Habitat selection index analysis shows that the snow rabbit main choice in the slope, slope, slope is less than 25 degrees, from human interference distance is greater than 1000 m mixed needle leaf and brush habitats; Principal component analysis showed that the concealed conditions, food, temperature and human disturbance is the main factor affecting the snow rabbit habitat selection.【总页数】3页(P276-278)【作者】刁钦尽;鞠丹;任梦非【作者单位】大兴安岭图强林业局资源科，黑龙江大兴安岭 165301;黑龙江省野生动物研究所，黑龙江哈尔滨 150081;黑龙江省野生动物研究所，黑龙江哈尔滨150081【正文语种】中文【相关文献】1.基于生境可获得性的完达山地区马鹿(Cervus elaphus xanthopygus)冬季生境选择 [J], 李言阔;张明海;蒋志刚2.大兴安岭林区雪兔冬季生境选择研究 [J], 刘浩;于洪伟;刘永志3.完达山东部林区冬季东北兔的生境选择 [J], 任梦非;黄海娇4.长白山地区黄鼬冬季生境选择 [J], 张伟;葛亮;沈广爽5.黑龙江完达山地区狍子冬季生境选择 [J], 周绍春;张明海;尹远新;任梦非因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
谈完达山林区东北虎生境状况与保护对策程伟【摘要】探讨了影响黑龙江省完达山东部林区野生东北虎数量、生境的因素,并对如何保护野生东北虎种群提出建议.【期刊名称】《林业勘查设计》【年(卷),期】2013(000)002【总页数】2页(P94-95)【关键词】东北虎;生境;评价;对策【作者】程伟【作者单位】黑龙江省第一森林调查规划设计院【正文语种】中文东北虎是我国濒危大型猫科动物之一，在生态系统中处于食物链的顶端，对其栖息地进行质量评价具有重要的生态学意义。
本文通过野外调查，结合3S技术，对完达山地区东北虎栖息地的适宜性进行评价，以此作为合理保护东北虎的有效依据。
据资料记载，早在80多年前黑龙江省东北虎的分布很广，即使在20世纪70年代中期大兴安岭仍然有东北虎的分布，但是，进入80年代，东北虎的分布面积急剧缩小，数量也大幅度减少。
目前，东北虎主要分布在我国的黑龙江省和吉林省以及俄罗斯的远东地区，其中，黑龙江省完达山东部林区是中国野生东北虎最为重要的分布区，活动区域为东方红林业局的五林洞、永幸、青山、奇源、东林、大牙克等林场和迎春林业局五泡、光明、永丰、尖山、曙光等林场。
1 影响东北虎生境选择的因子东北虎的种群数量和分布是影响东北虎生境选择的主要原因之一。
由于捕杀、森林采伐、道路建设、人口增长、旅游开发等多种因素干扰，导致东北虎的分布区域逐渐缩小。
栖息面积的减少和生境遭到破坏给野生东北虎及其猎物种群生存带来了极大威胁，同时也给野生动物保护者保护这一濒危物种带来了巨大挑战。
2 限制东北虎种群增长的因素①东北虎种群数量小，有效繁殖率低;②东北虎生存所需的食物，如马鹿、野猪、狍子、山兔等动物急剧减少导致东北虎食物链断裂;③不法分子非法盗猎，导致东北虎迁徒或活动领地缩小;④森林采伐导致森林分布面积减少，生境质量恶化。
3 东北虎的生境选择东北虎对林区自然环境的选择是十分苛刻的，林地的坡度、坡向、海拔、河流、植被类型、与居民点的距离、与主公路的距离、与林间运材道的距离等都对东北虎的生存构成很大影响。
野生动物Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｍａ１ ｏｆ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ ２０１０，３１（２）：５９—６２ 黑龙江省完达山东部林区马鹿微卫星位点的筛选 张辉张明海 （东北林业大学野生动物资源学院， 罗理扬 哈尔滨，１５００４０）
摘要：利用黑尾鹿、白尾鹿等近缘物种的１８对微卫星引物，对２个东北马鹿肌肉ＤＮＡ样品和１７６个粪便ＤＮＡ样品 进行扩增，通过毛细管电泳法筛选适合东北马鹿的微卫星位点。结果表明，其中３个位点为高度多态性位点 （ＰＩＣ＞０．５），１个为中度多态性位点（０．５＞ＰＩＣ＞０．２５）。共检测到２６个等位基因片段，平均每个位点６．５个等位 基因。多态信息含量０．３９３～０．８２７，个体识别率０．６４３～０．９５８，累积个体识别率为０．９９９９，累积非父排除率为 ０．９９７６。这４个多态性微卫星位点为东北马鹿的遗传研究提供了理论依据。 关键词：马鹿；微卫星位点：粪便ＤＮＡ 中图分类号：Ｑ７５，Ｑ９５９．８４２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００—０１２７（２０１０）０２—０５９—０５
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ ｉｎ Ｗａｐｉｔｉ ｆｒｏｍ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｗａｎｄａ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ Ｚｈａｎｇ Ｈｕｉ Ｚｈａｎｇ Ｍｉｎｇｈａｉ Ｌｕｏ Ｌｉｙａｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｗｉｌｄｌｉｆｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，１５００４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：１８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｆｒｏｍ ｂｌａｃｋ—ｔａｉｌｅｄ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｔａｉｌｅｄ ｄｅｅｒ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ＤＮＡ ｍｉｃ— ｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ２ ｗａｐｉｔｉ（Ｃｅｒｖｕｓ ｅｌａｐｈｕｓ ｘａｎｔｈｏｐｙｇａｓ）ａｎｄ １７６ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｆｅｃｅｓ ｏｆ ｗａｐｉｔｉ．Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ３ ｐａｉｒｓ ｏｆ １ ８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ １ ｗａｓ ｍｅｄｉｕｍ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．２６ ａｌｌｅｌｉｃ ｌｏｃｉ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ，ｗｉｔｈ ６．５ ａｌｌｅｌｅｓ ｐｅｒ ｌｏｃｕｓ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｒａｎｇｅ ０．３９３ ｔｏ ０．８２７，ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ０．６４３ ｔｏ ０．９５８，ｔｏｔａｌ ｐｏｗｅｒ ｏｆ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ０．９９９９ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐａｔｅｒｎｉｔｙ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｗａｓ ０．９９７６．Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ４ ｌｏｃｉ ｗｅｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｏ ｇｅ－ ｎｅｔｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｗａｐｉｔｉ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｗａｐｉｔｉ；Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ；ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
马鹿（Ｃｅｒｖｕｓ ｅｌａｐｈｕｓ ｘａｎｔｈｏｐｙｇｕｓ）是我国东北地区 典型的林栖大型有蹄类动物，为国家Ⅱ级重点保护野生 动物，在阔叶红松林生态系统中发挥着重要的生态作 用 ，并具有很高的经济价值。 微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ），也被称为短串联重复 （ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＴＲ），是指以１～６个核苷酸为基 本重复单位的串联重复序列 Ｊ，广泛存在于真核生物基 因组中，长度较短，多在４００ ｂｐ以下，易于聚合酶链式 反应（ＰＣＲ）扩增，在动物的个体识别、亲子鉴定、基 因连锁分析、群体遗传研究和遗传性疾病诊断等方面正 发挥着巨大的作用 。 为了从微卫星ＤＮＡ中得到有效的生物学信息，就必 须进行微卫星分析，多态性微卫星位点的获得是微卫星 分析的关键。对于多态性微卫星位点，不同的等位基因 表现为不同长度的扩增片段。目前已经发展出多种电泳 技术来检测等位基因大小，主要有聚丙烯酰胺凝胶电 泳、荧光标记一毛细管电泳技术等。毛细管电泳法 （ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）是近几年崛起的高效快速 的分离分析技术。此法最主要的优点是快速、微量、分 辨率高、重复性好、易于定量和自动化。毛细管电泳法 对于微卫星的分型非常稳定和精确。将多重ＰＣＲ产物在 同一根毛细管中电泳，所能容纳的位点数多达１６个。另 外，选用的分子量标准与待测样品在同一根毛细管中电 泳，更增加了片段长度测量的精确度。更有文献表明荧 光标记全自动测序技术进行微卫星分型的灵敏度高于聚 丙烯酰胺凝胶电泳 。 基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０８７０３０９）；黑龙江省自然科学基金重点项目（ＺＪＮ一０５０１ 第一作者简介：张辉，女，２５岁，硕士研究生；主要从事野生动物分子生物学方面的研究。 通讯作者：张明海，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｍｉｎｇｈａｉ２００４＠１２６．ｅｏｍ 张辉等：黑龙江省完达山东部林区马鹿微卫星位点的筛选 ２期 微卫星ＤＮＡ多态位点为马鹿等有蹄类动物的遗传结 构和多样性等研究提供了新的分子研究方法。我国鹿科 动物粪便ＤＮＡ研究刚刚起步，目前已有马鹿粪便ＤＮＡ 提取质量¨ 、利用粪便ＤＮＡ鉴定马鹿性别Ｅｌ４］和种群大 小 等方面的研究，但尚未见关于东北马鹿微卫星位点 筛选的专门报道。因此，本文旨在筛选高效的马鹿多态 性微卫星位点，为马鹿的遗传多样性保护工作提供重要 的科学依据。 １材料与方法 １．１实验材料 本实验的１７６个马鹿粪便样品和２个肌肉样品均来 自黑龙江省完达山东部林区。采集粪便样品时，每堆随 机选取ｌ０粒粪球，戴一次性ＰＥ手套将其装入封口袋 中。由于正值冬季，气温一１５℃～一３０％，所以取样期 间将样品保存于室外避光环境中。带回实验室立即保存 于一２０℃冰箱中。 １．２ ＤＮＡ提取及检测 粪便样品ＤＮＡ的提取使用德国ＱＩＡＧＥＮ公司的粪便 ＤＮＡ提取试剂盒（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）。肌肉样 品ＤＮＡ的提取采用常规的酚／氯仿抽提法¨ 。提取结束 后取３ ＩｘＬＤＮＡ进行１．０％琼脂糖凝胶电泳，检验是否提 取成功。然后将ＤＮＡ分装并保存于一２０℃，使用时取小 包装保存于４℃。 １．３微卫星位点的选择 根据微卫星位点在近缘物种中的保守性，本实验选 择了曾在黑尾鹿和白尾鹿¨ Ｉ２ 等物种中获得良好多态性
的１８对引物进行筛选（表１）。引物由上海生工生物工 程技术服务有限公司ｆ Ｓａｎｇｏｎ）合成，并用灭菌双蒸水 配制成浓度为１００ ｔｘｍｏｌ／Ｌ的储存液备用。
表１ １８对微卫星位点引物序列
１．４微卫星位点的初步筛选 反应体系总体积为２０ ：０．１ Ｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒ、 ２ Ｌ Ｅｘ Ｔａｑ １０×Ｂｕｆｆｅｒ、２ Ｌ ｄＮＴＰ、２ ｔｘＬ ＢＳＡ（０．０２ ｍＬ）、０．５ ＩｚＬ上下游引物（１０ ｐｍｏｌ／Ｌ）、模板ＤＮＡ，加 灭菌去离子水至体积为２０ Ｌ。 反应条件：９５℃预变性１０ ｍｉｎ，每个循环包括９５℃ 变性３０ ｓ，５１～６０ｏＣ退火４０ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，共４０个 循环，最后７２￣Ｃ延伸１０ ｍｉｎ，４￣Ｃ保存。 使用ＰＣＲ扩增仪（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００）进 行扩增，并设退火温度梯度和模板ＤＮＡ浓度梯度，以寻 找各对引物的最适退火温度和模板ＤＮＡ量。ＰＣＲ产物 经１．０％琼脂糖凝胶电泳检测，经ＥＢ染色后，在凝胶成
像系统中观察扩增效果，并拍照记录。判断各对引物是 否能够从东北马鹿肌肉ＤＮＡ中扩增出特异性产物。选择 有阳性产物的引物扩增随机抽取的８０份粪便ＤＮＡ，并 电泳成像。 １．５筛选多态性高的微卫星位点 将初步筛选出的引物重新合成，在上游引物５ 端分别 标记三色荧光ＦＡＭ、ＨＥＸ和ＴＡＭＡＲＡ。使用１７６份粪便 ＤＮＡ样品进行扩增。扩增产物取３ 进行１．Ｏ％琼脂糖 凝胶电泳，检验ＰＣＲ反应是否成功，失败的重新扩增。 为获取准确的基因型，本实验重复进行３次ＰＣＲ扩增。 每３种不同荧光标记的阳性ＰＣＲ产物按比例混合成 １组，每组５ Ｌ左右，低温送至北京基诺博实生物技术 野生动物Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ ２０１０，３１（２）：５９—６２ ６１ 有限公司测定等位基因的大小，该公司使用ＡＢＩ ３７３０基 因分析仪（ＡＢＩ ３７３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）。 １．６数据处理 应用Ｃｅｒｖｕｓ ３．０软件，统计各微卫星位点的等位基 因数目、杂合度、多态信息含量、个体识别率及非父排 除概率等参数。
２结果与分析 ２．１ ＤＮＡ提取及检测 对２份肌肉ＤＮＡ和１７６份粪便ＤＮＡ进行１．０％琼脂 糖凝胶电泳（图ｌａ，ｂ），结果显示，提取的肌肉ＤＮＡ和 粪便ＤＮＡ的质量都很高，完全可以用于马鹿的遗传分析。 Ｍ １ ２ Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １Ｏ
２ ０００ｂｐ国２０ ０ｂｐ圆
ａ ｂ 图１ 部分东北马鹿ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果 ａ：肌肉ＤＮＡ；ｂ：粪便ＤＮＡ。 ２．２微卫星引物的初步筛选 本实验采用的ｌ８对微卫星引物中有ｌ０对在２份肌 肉ＤＮＡ中均可扩增出清晰稳定的谱带。这１０对引物中 有７对在１７６份粪便ＤＮＡ中均可扩增出清晰稳定的条带 （图２）。 Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７
图２ ＰＣＲ产物电泳图 １．Ｃｅｒｖｉｄｌ；２Ｎ；３．Ｋ；４．ＢＭ２０３；５．ＢＭ８４８；在ＯＣＡＭ； ７．ＩＬＳＴＳＯ１ｌ ２．３筛选多态性高的微卫星位点
通过毛细管电泳和基因型分型（图３），使用Ｃｅｒｖｕｓ ３．０软件进行分析（表２）。
表２ ４个微卫星位点的分析
图３位点Ｎ的毛细管电泳峰值图 由图２可知，位点Ｃｅｒｖｉｄｌ、Ｋ和ＩＬＳｑＶ．．￣Ｉ１的等位基 因数均小于３，Ｎ、ＢＭ２０３、ＢＭ８４８和ＯＣＡＭ的等位基因 数在３～ｌ１个之间，这４个微卫星位点共扩增出２６个等 位基因，平均每个位点有６．５个等位基因，其中，位点 Ｎ的等位基因数为３个，ＢＭ８４８为７个，ＢＭ２０３为１１ 个，ＯＣＡＭ为５个。 ４个微卫星位点的多态信息含量０．３９３～０．８２７，平 均为０．６４６３，其中，ＢＭ８４８、ＢＭ２０３和ＯＣＡＭ为高度多 态性位点（０．５＞ＰＩＣ），位点Ｎ为中度多态性位点 （０．５＞ＰＩＣ＞０．２５）。观测杂合度范围０．５４１～０．９７３，期 望杂合度范围０．４９６～０．８５７，平均期望杂合度为 ０．７０６６，观测杂合度普遍高于期望杂合度。 ４个位点的个体识别概率范围在０．６４３～０．９５８之 间，累积个体识别概率为０．９９９９。亲权排除概率范围 ０．１２～０．６９１，累积非父排除概率为０．９６９９（ＮＥ一１Ｐ） 和０．９９７６（ＮＥ一２Ｐ）。
