第九章_兽药残留分析

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• 常见的四环素类药物包括：四环素（TC ）、 土霉素（ OTC ）、金霉素（ CTC ）、强 力霉素（DC ）、二甲胺四环素（MINO ）、 甲烯土霉素（MTC ）、去甲基金霉素 （DMCTC ）和毗甲四环素（PRMTC ）等
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• 2.液-液分配 • 可通过将待测化合物从水相转移到不互溶 的有机相而直接去除基质成分。 • 存在问题：四环素类化合物由于极性太强， 在任何 pH 值都不能被定量转移入不互溶的 有机相。 • 当采用四丁基铵盐作为离子对试剂时，在 pH8.2 条件下采用二氯甲烷提取土霉素和四 环素的回收率超过 85 ％。
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• 3、超剂量、超范围（对象）用药
4.不遵守有关标签的规定
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二、兽药残留的危害
• 1.对人体产生直接毒性作用 1）急、慢性毒性 • 2）激素样作用 • 3）过敏反应 2.对人类胃肠道微生物平衡产生破坏 • 3.增强人类病原菌的耐药性 • 4.环境危害
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• 1.微生物抑制法 • 微生物法是一种传统的测定四环素类化合 物和其他抗生素的分析方法。 • 测定原理：是根据抗生素对其敏感的特定 微生物的生长抑制作用 ,通过抑菌圈的大小 来进行样品中抗微生物药物残留的判断(测 定抑菌圈直径，样品抑菌圈直径小于阳性 对照抑菌圈直径判定为阴性，否则判定为 阳性)。
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• 2.酶联免疫法 • 间接酶联免疫法可用来检测牛奶中的四环素类抗 生素。 • 四环素-牛血清白蛋白共轭物用于抗体制备，同源 的四环素- β -酪蛋白共轭物作为包埋试剂，而羊 抗兔 IgG-辣根过氧化物酶作为第二抗体。 • 牛奶样品经离心脱脂，采用磷酸盐缓冲液至少以 1 :30 的比例进行稀释后，直接采用酶联免疫法进 行测定，检测限可达 5 ug / kg 。
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• 1.固相萃取 • SPE 由于不需要大容量的溶剂，样品基质中的四 环素类抗生素。又省时省力，固相萃取被广泛用 于分离和净化生物样品中的四环素类抗生素。 • TCs 具有苯环、多种活性官能团，因此各种如的 SPE 都能用于 TCs 的净化， SPE 主要包括 C18 柱、阳离子交换柱、苯基 SPE 柱等。 • 应用于分部环素类抗生素的固相萃取剂主要为反 相 C18 吸附剂。由于四环素类抗生素易于和金属 离子鳌合，为避免待测物在过固相萃取柱时的潜 在损失，一般先采用 EDTA 对反相固相萃取柱进 行预处理。
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• 金霉素、土霉素和去甲基金霉素是 3 种由 微生物自然产生的四环素类药物，已经被 成功地从真菌中分离出来； • 其他四环素类药物如强力霉素、甲烯土霉 素、二甲胺四环素、毗甲四环素及四环素 则是通过半合成法制备的
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• 二、四环素类抗生素的毒性及其代谢 • 四环素类药物为广谱抗生素，是相互关系 密切的抑菌性抗生素，抗菌谱和毒性相似， 对多种α-溶血性链球菌、非溶血性链球菌、 革兰阴性杆菌、立克次体、螺旋体、支原 体属和衣原体属均有效。
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• 3.薄层色谱法 • 薄层色谱法（ TLC ）又分为正相薄层色谱（ NPTLC ）和反相薄层色谱（ RP -TLC ）。 • 正相薄层色谱一般使用纤维素、硅胶、硅藻土等 作为吸附层。总体而言，正相薄层色谱是一种简 单的、不需特殊设备的分离方法，但在制板时却 要花费大量时间消除 TCs 与金属离子的鳌合作用， 故通常在吸附剂和溶剂系统中加入 EDTA 以消除 金属离子的影响。
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• 多数四环素类化合物对光敏感，而且在强 酸或碱性条件下不稳定，在弱酸性 （ pH=3 ）条件下形成差向异构体，在强 酸性（ pH < 2 ）条件下形成脱水产物。
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• 分析液体样品（如牛奶）中的四环素类抗 生素残留时，一般需要一个预离心步骤以 除去脂肪。 • 在净化步骤之前，还需采用乙酸盐缓冲液、 磷酸盐缓冲液对样品进行稀释。对于半固 体样品，如肌肉、肾脏、肝脏，通常需要 更强烈的样品预处理步骤以破碎组织。可 采用切碎机和组织均质器通过机械分散作 用来完成这一步骤。
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• 当采用商业化试剂盒检测蜂蜜中的四环素、 金霉素和土霉素残留时发现其对金霉素具 有强烈的交叉反应活性。试剂盒对四环素 和金霉素的检测限均为 15 ug / kg ，但由于 所用抗体与土霉素的交叉反应活性较低， 对土霉素的检测限为 250 u g / kg ． • 实验表明，空白蜂蜜样品经缓冲液稀释 50 倍已足以消除基质干扰。
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• 由于四环素类药物普遍为低亲脂性，因此 在脂肪中检测不到四环素类药物残留。 • 相反，由于四环素类抗生素对钙具有亲和 性，能在家禽、猪、牛以及鱼类的骨骼组 织中蓄积。
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（二）四环素类抗生素的毒性与最大残留限 量 四环素类抗生素口服吸收良好，分布广泛， 易在骨骼和牙齿中沉积；可在肝脏中富集， 造成肝损害。
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抗生素类药物广泛地应用于各种感染性疾病， 其品种繁多。 市场上有售的常用的品种： 1. 四环素类 2. 大环内酯类 3. β-内酰胺类 4. 氨基糖甙类 5. 氯霉素类
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第一节 四环素类
• 一、四环素类化合物的结构和性质 • 四环素类抗生素（TCs）具有共同的基本母 核（氢化并四苯环），仅取代基有所不同。
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兽药残留
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一、兽药定义及兽药残留来源
• （一）兽药定义 • 1.兽药 • 是指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者 有目的地调节动物生理机能的物质（含药 物饲料添加剂），主要包括：血清制品、 疫苗、诊断制品、中药材、中成药，化学 药品、抗生素、生化药品、放射性药品、 外用杀虫剂、消毒剂等。
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• 在我国，鱼药、蜂药、蚕药也列入兽药管 理。 • 2.兽药残留 • 对食品动物用药后，动物产品的任何食用 部分中的原型药物或/和其代谢产物，包括 与兽药有关的杂质的残留。
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• （二）兽药残留来源 • 现代养殖业日益趋向于规模化、集约化， 不可避免地带来了大量的疫病问题，为了 提高饲料报酬和满足人们对动物性食品的 需要，需要大量使用饲料药物添加剂，这 已成为保障我国畜牧业发展不可少的一环。
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• （二）样品净化 • 在样品提取步骤获得的水相或有机相样品提取液 中待测四环素类抗生素的浓度可能非常低，而且 还可能含有共提取物。如果样品的最终溶液中含 有共提取物，会增加检测器的背景噪声，难以检 测痕量浓度水平的待测物质。为减少干扰和浓缩 待测化合物，初始样品提取液需要采用进一步的 净化步骤，如液一液分配、固相萃取、超滤、免 疫亲和色谱或在线微量富集技术。
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• 目前，造成我国兽药残留的原因，大致有 如下； 1.非法使用违禁药物 • 滥用己烯雌酚给鸡催肥 ； • 盐酸克仑特罗（又叫瘦肉精 ）； • 在饲料中添加避孕药、雌性激素养黄鳝、 甲鱼 ；
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• 2.不遵守休药期规定 • 兽药用于防病或治病是有疗程规定的，有 病的动物也不可能无休止地吃药，特别是 药物饲料添加剂，都规定了休药期 。 • 如抗菌促生长的喹乙醇预混剂，体药期是 35天 。
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• 反相薄层色谱分析 TCs 时，溶剂系统中通 常加入草酸以消除金属离子的影响．在 RP -TLC 溶剂体系中通常含有磷酸、柠檬酸、 酒石酸、 EDTA 等以获得对TCs好的分离效 果，但脱尾现象比较严重；在 RP-TLC 溶 剂体系中加人草酸后，可以消除 TCs 与金 属离子的鳌合作用，减少脱尾现象。
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四、抗生素类兽药
• 抗生素是由细菌、真菌或其他微生物在生 活过程中所产生的物质，具有抑制或杀灭 细菌、真菌、螺旋体、支原体、依原体等 致病微生物的作用。 • 抗生素是能抵抗致病微生物的药物，是抗 菌消炎药中最大的一类。
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• （三）四环素类兽药的分析 • 四环素类抗生素残留的测定方法主要包括 微生物抑制法、 酶联免疫法、分光光度法、 薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱 一质谱法等。样品经过提取和净化后，四 环素类抗生素可通过薄层色谱或液相色谱 进行分离，再采用分光光度、荧光或质谱 检测系统进行定量浦定。
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三、常见兽药的种类
1.抗生素类药物 2.磺胺类药物 3.硝基呋喃类药物 4.抗寄生虫类药物 5.激素类药物
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分析方法主要有微生物分析法、放射化学法、 免疫法（包括放射免疫法、酶联免疫法、 荧光免疫法、化学发光免疫法）、气相色 谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法（包 括柱前和柱后衍生荧光法）、液相色谱-质 谱法和气相色谱-质谱法。
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• 蜡状芽抱杆菌 ATCC 11778 是一种经典的用于分 析四环素类的微生物，其对金霉素的灵敏度为 0.005mg / L ，对四环素和土霉素的灵敏度为 0.025mg / L ，对二甲胺四环素的灵敏度为 0.001~0.002mg / L 。 • 相对于其他分析方法，微生物抑制法操作简便、 价格低廉、不需要精密仪器和复杂的样品前处理 过程，因而适合大量样品的筛选。 • 微生物抑制法的最大缺点是不能区分具体的四环 素种类，因此也难以进行定量检测。
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• 将四环素类抗生素从可食动物产品中分离 出来是一个相当复杂的步骤。 • 主要困难在于这些化合物在被分离时倾向 于与金属离子形成鳌合物或与样品基质成 分键合。 • 为提高提取效率，推荐采用EDTA 、柠檬 酸盐、琥珀酸盐或草酸等四环素类化合物 的竞争性鳌合剂。同时需要考虑采取适当 的提取条件以减少与蛋白质的键合。
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三、四环素类兽药残留样品前处理
• （一）样品提取 • 由于四环素类抗生素的强极性性质，在生 物样品中易与蛋白质形成共轭物而提取困 难。稀无机酸可将四环素类化合物与蛋白 质分离，但四环素类化合物一旦进入水相， 由于其在有机相的分配系数较低，再将其 提取入易挥发的有机相进行浓缩和净化就 变得困难了。
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• 四环素类抗生素在动物养殖中应用广泛， 主要作为饲料添加剂用于预防和治疗疾病。 近些年来，在牛、猪、绵羊、山羊、家禽 及水产养殖中常用的四环素类抗生素主要 是土霉素、金霉素、四环素和强力霉素等。
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• （一）四环素类抗生素的代谢 • 四环素类药物的给药可通过几种方式： • 口服（添加到饲料或饮用水中）、注射及 通过乳腺注入。 • 无论采用何种给药方式，四环素类抗生素 都能在体内广泛分布，而在肾脏和肝脏组 织中含量尤高。
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• 强酸或酸性脱蛋白剂非常适合用来降低四 环素类化合物与蛋白质的键合作用，但在 强酸性条件下四环素类抗生素易降解为脱 水产物。 • pH4 .0 的琥珀酸盐缓冲液、酸性乙睛和酸 性甲醇都被成功应用于四环素类抗生素的 提取。
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