嗜水气单胞菌感受态细胞的制备

感受态细胞的制备（Hanahan法）什么是感受态细胞？野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。

经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。

那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。

这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。

制备的关键因素：1.所用转化缓冲液的试剂纯度用高纯度的水和二甲亚砜（DMSO）制备感受态细胞是最重要的，包括细菌培养基在内的某些试剂会随着储存期的延长而降低效能。

无论何时，尽可能用新买的试剂和生长培养基。

2.细菌的生长状态由于未知的原因，最高的转化效率总是用从直接取自冻存于-70℃的储备菌中直接培养获得的，因此，不应该使用在实验室连续传代或存放于4℃或室温的培养物。

3.玻璃和塑料器皿的清洁微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅的降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（Mini-Q 或相当的水）充满，再经高温高压消毒。

水在玻璃器皿使用前应倒掉。

注意：很多手工操作后用来消毒的塑料器皿和滤膜上是含有严重影响转化效率的洗涤剂的。

材料缓冲液和溶液二甲亚砜DMSODnD溶液（DMSO和DTT）DTT（二硫苏糖醇）1.53gDMSO 9ml1mol/L乙酸甲（PH7.5）100μl 加水补至10mlDnD溶液可用耐受有机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。

转化缓冲液标准的转化缓冲液（TFB）现用现配。

冻存的缓冲液（FSB）用来冻存（-70℃）感受态细胞培养基SOB琼脂板含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁和适量的抗菌素SOB培养基含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁SOC培养基每次转化反应需要1ml的SOC培养基核酸和寡核苷酸质粒DNA（重组质粒）离心机和转头Sorvall GSA转头或与之相当的转头专用设备液氮预冷的聚丙烯离心管（50ml）预冷的聚丙烯离心管（17*100mm；Falcom2059）预置的40℃水浴载体和菌种冻存的做转化用的大肠杆菌（该菌种需在-70℃下保存）方法和步骤（重要：本方案中的所有步骤均应在无菌条件下进行）细胞制备1.转化缓冲液的制备若制备立即使用的感受态细胞可用FTB。

感受态细胞的制备步骤和原理实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。

制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

本次实验的目的就是增加质粒的数量。

同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。

实验原理及过程实验步骤1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37℃，180rpm 培养过夜。

[ 让菌复苏，进入对数期的早中期。

此时更容易制得感受态细胞。

]2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37℃250rpm大约2.5 小时。

[ 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。

]3 取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。

（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）[ 使细菌的生长停止，代谢减慢。

因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。

]4 菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2 中，轻吹，4℃ 30min ，4000rpm 离心5min 弃上清。

[ 细菌处于0 度，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。

（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]5 菌体重悬于1mL 100mmol/L 冰冷的CaCl2 中，轻吹，用于转化。

[ 除去所有的LB 以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。

防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。

（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]6 取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a 质粒，冰浴30 min 受体菌：感受态细胞100uL ，加入 2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2 溶液100uL，加入 2 uL 阴性对照[ 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a 质粒未被污染。

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化（实验步骤）分组：每组同学分成2个小组，每个小组2-3位同学。

1. 感受态细胞的制备(1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期（老师做）。

(2) 将该菌悬液以1:50的比例重新接种于5ml LB液体培养基中（2组），37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

(3) 将5ml培养液转入3只1.5mL离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下5000r/min离心5分钟（每组3只）。

(4) 弃去上清，在每个离心管中用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15分钟后，4℃下5000r/min离心5分钟。

(5) 弃去上清加入0 2ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。

将感受态细胞悬液分装成2份，每份100μl（注意悬液密度要均匀）。

冰上放置备用（每组有6份感受态细胞）。

2. 铺平板将配好灭菌的LB固体培养基加热溶化，待冷却至60℃左右，加入卡那霉素储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。

3. 感受态细胞的转化(1) 将100μl感受态细胞悬浮液，置冰上5分钟，然后加入5ul pBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30分钟（每组做2份）。

(2) 42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

(3) 向管中加入400ul LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

(4) 将上述500ul菌液中取出200ul涂布于1块含卡那霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

（每组2块平板）(5) 同时做两个对照：对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。

嗜水气单胞菌噬菌体的分离纯化及生物学特性分析嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)在自然界的水体中普遍存在,是水产养殖中非常重要的鱼类病原体。

由于抗生素的大量使用及滥用,耐药菌株不断增加,药物残留问题越来越严重,防治该菌感染已成为当今水产养殖业的一大难题。

噬菌体(bacteriophage,phage)是一种细菌病毒,具有特异性强、裂解效率高、无残留等特点。

因此研究嗜水气单胞菌噬菌体来防控该类疾病具有重要意义。

本试验从南京不同地区采集池塘水样5份,污染河流水样2份,普通河流水样3份,利用双层平板法分离嗜水气单胞菌噬菌体,得到25株噬菌体分离株。

分离纯化后进行宿主谱的测定,参与检测的有273株气单胞菌。

试验中发现,25株噬菌体综合起来能够裂解20株嗜水气单胞菌,2株维氏气单胞菌,1株动物气单胞菌,而且不同噬菌体分离株裂解嗜水气单胞菌的宿主范围有一定的重叠性,说明当前流行的嗜水气单胞菌有其主要的噬菌体型。

为进一步了解嗜水气单胞菌噬菌体的生物学特性,本试验选择了性质稳定、宿主范围相对较广的5株噬菌体进行生物学特性分析。

研究结果显示,N21、W3和G65属于肌尾噬菌体科,而Y71和Y81属于短尾噬菌体科;噬菌斑除G65外均清楚无晕环,大小无明显差异;5株噬菌体一步生长曲线表明,潜伏期均约为10 min,生长期分别为 70 min、135 min、90 min、105 min 和 105 min,平均裂解量分别为 316 PFU/cell、160PFU/cell、260PFU/cell、200PFU/cell、220PFU/cell。

5 株噬菌体均对高温敏感,对pH适应性较广,突变频率在10-6～10-7之间。

5株噬菌体的动物试验发现,感染30 min治疗6 h,噬菌体治疗组小鼠的细菌载量均低于感染组,表明5株噬菌体对感染小鼠有治疗作用,其中N21和Y81作用更为显著。

综上所述,我们分离了 25株嗜水气单胞菌噬菌体,筛选出宿主谱相对较宽、潜伏期短、裂解率高、理化性质稳定、突变频率低的噬菌体,并通过动物试验来评估噬菌体疗法的安全性和有效性,为噬菌体在临床中的使用奠定了基础。

感受态细胞的制备（DH5α）一、准备工作所有试剂、容器均需提前预冷。

1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。

2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。

② SOB培养基（Super Optimal Broth）③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl20.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。

然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。

（装在50ml离心管，封口4度保存）④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl20.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。

然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。

配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。

（50ml离心管分装）在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。

2.配制2 M MgCl2溶液。

（50ml离心管分装）在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。

5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。

感受态细胞的制备方法
感受态细胞是一种特殊的细胞状态，可以用于研究细胞对外界刺激的感知和响应。

以下是一种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 培养细胞：选择需要研究的感受态细胞类型，如神经元、免疫细胞等，在细胞培养基中培养细胞至合适的生长状态。

2. 刺激处理：给予细胞一定的外界刺激，如药物、光刺激、温度变化等。

刺激的剂量和时间可以根据具体研究目的进行调整。

3. 收集细胞：在刺激处理后，收集细胞，可以通过离心等方法使细胞沉积在培养皿底部或离心管中。

4. 提取RNA或蛋白质：利用相应的方法提取细胞中的RNA或蛋白质，用于后续分析。

5. 分析感受态：通过各种分析方法，如实时定量PCR、Western blot、流式细胞术等，检测特定的感受态标记物的表达水平或蛋白质修饰情况。

感受态细胞的制备方法可以根据具体研究目的和细胞类型的不同而有所差异，因此在实际操作过程中需要根据具体情况进行调整和优化。

（写作参考：）。

一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。

2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。

3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。

4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。

5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。

6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。

大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。

二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。

2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。

3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。

感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10mllb液体培养基的50ml离心管中。

（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16小时。

3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000mllb液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次od，当od值达到0.3-0.4时，停止培养。

4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

离心5分钟后，向杯中加入少量H2O，然后以4000转/分的转速悬浮。

6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。

7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油,4℃,4000rpm,离心10min。

8.丢弃上清液，向每个离心杯中加入5毫升10%甘油，以暂停沉淀，然后将细菌溶液分装在1.5毫升离心管中，每管300微升，并储存在-80℃的冰箱中。

同时取100μL主管态加0.01ngpuc18直接电穿孔转化检测转化效率。

9.次日观察转化子生长情况，并记录。

二、连接产物纯化1.将连接产品转移至1.5毫米彭多夫管中，并添加以下试剂：10μlofddh2o2μlof3mnaac（ph5.2）50μl无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，topspeed离心30分钟；3.小心清除上清液，避免接触管道底部的沉淀物；4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，topspeed离心5分钟；6.小心地去除上清液，并将Eppendorf管置于空气中，直到没有乙醇气味；7.将10μLddh2o重新溶解和沉淀，并在4℃下短期储存，在-20℃下长期储存；3、电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2.取1μL纯化质粒置于1.5ml离心管中，用0.1cm电极杯冰上预冷。

嗜水气单胞菌聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的初步研究利用优化的电转化条件(电场强度为12.5 kV／Cm、脉冲时间为5 ms、电阻1000 O)转化早静止期制备的嗜水气单胞菌WQ株感受态细胞，每微克广泛宿主质粒pBBR1MCS1 DNA可获得约400个具有氯霉素抗性的转化子，质粒DNA在嗜水气单胞菌中可稳定保存。

PCR扩增得到的氯霉素抗性基因被插入到嗜水气单胞茵Ⅰ型PHA合酶基因中间，获得带有Ⅰ型PHA合酶断裂基因的自杀质粒pFH5(6.5 kb)。

利用优化的电转化条件，自杀质粒pFH5 DNA转化嗜水气单胞菌感受态细胞，通过细胞内同源重组，氯霉素抗性基因被整合到嗜水气单胞菌细胞的基因组上，获得嗜水气单胞菌Ⅰ型PHA合酶缺失突变株。

野生型嗜水气单胞菌仅可利用月桂酸作为碳源合成PHBHHx，高浓度葡萄糖对其生长有抑制作用，而获得的嗜水气单胞菌Ⅰ型PHA合酶缺失突变株具有明显不同于野生型的特点，可以以月桂酸和葡萄糖作为碳源产生中长链PHA(mcl PHA)，表明在野生型嗜水气单胞菌中存在另一个功能被隐藏的Ⅱ型PHA合酶基因。

根据假单胞菌Ⅱ型PHA合酶基因操纵子区保守序列设计引物，以野生型嗜水气单胞菌基因组为模板，PCR扩增得到2.9 kb产物。

该区间的DNA序列包含一个1680 bp新的Ⅱ型PHA合酶基因，该基因与假单胞菌Ⅱ型PHA合酶基因具有非常高的同源性，该基因可在恶臭假单胞菌PHA缺失突变株中积累中长链PHA。

嗜水气单胞菌Ⅰ型和新克隆的Ⅱ型PHA合酶同源性比较和氨基酸序列比对表明，新克隆的Ⅱ型PHA合酶与Pseudomonas putida等表现极高的同源性，具有与上述假单胞菌相似的保守区和保守序列。

而二者同源性水平很低，表明它们由不同的pha区编码，具有不同的生理特点和底物专一性。

综上所述，野生型嗜水气单胞菌不能利用葡萄糖或月桂酸产生中长链PHA，仅可利用月桂酸作为碳源产生PHBHHx，而Ⅰ型PHA合酶缺失突变株能利用葡萄糖或月桂酸产生中长链PHA，表明中长链PHA合成途径的活化。

嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析陈红燕;林天龙;陈日升;杨金先;陈强【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2003(010)002【摘要】利用杂交瘤单克隆抗体技术制备了AHYT-1和AH10501 2株嗜水气单胞菌的菌体单抗,筛选出11个能稳定分泌抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的细胞株,并对这些单抗进行了特性分析.经单抗类型测定,这些单抗分属IgM、IgG2α 2个亚类,且均具有ELISA反应特性,腹水抗体效价在1∶104～1∶106,其中单抗4G4、2H4、GH9具有免疫荧光特性.ELISA特异性分析结果表明,4G4、2H4、FA4、GH9、CF2为嗜水气单胞菌血清型特异性单抗,4G4、2H4识别同一种血清型的嗜水气单胞菌分离株,而FA4、GH9、CF2却识别另外一种血清型的嗜水气单胞菌,并且与其他血清型的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌以及鳗弧菌、爱德华氏菌、克鲁氏耶尔森菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌均不反应.Western-blot结果表明,单抗4G4、2H4、FA4所针对的抗原是菌体脂多糖(LPS),且它们所识别的LPS抗原表位不同.菌体单抗研究结果表明,4G4、2H4和GH9 3株单抗可应用于嗜水气单胞菌的诊断和血清分型.本研究目的旨为建立一种快速诊断鱼类嗜水气单胞菌病的方法和血清分型方法.【总页数】5页(P121-125)【作者】陈红燕;林天龙;陈日升;杨金先;陈强【作者单位】福建省农业科学院,畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院,畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院,畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院,畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院,地热农业利用研究所,福建,福州,350003【正文语种】中文【中图分类】S948【相关文献】1.温和气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析 [J], 黄钧;梁明龙;朱芸2.杀鲑气单胞菌单克隆抗体的制备及其特性分析 [J], 林娟娟;陈强;刘荭;杨金先3.温和气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析 [J], 黄钧;梁明龙;朱芸4.嗜水气单胞菌气溶素单克隆抗体的制备及初步应用 [J], 郭闯;方苹;郭立新;陈辉5.抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及初步鉴定 [J], 陈瑞;于辉;唐旭;金晓航;黄威权;师建国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第1期2020年1月No.1January ，2020嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPU01的构建、表达和鉴定张莉，张小蒙（江苏医药职业学院药学院，江苏盐城224005）摘要：为构建嗜水气单胞菌穿梭质粒载体，试验根据质粒pBK760基因序列设计特异性引物，对质粒pBK760进行PCR 扩增，并将纯化后的PCR 产物连接到pMD20载体中，构建嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPU01，提取重组质粒载体进行鉴定，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入嗜水气单胞菌，获得具有标记抗性基因的嗜水气单胞菌。

结果显示，构建的嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPU01经PCR 和酶切鉴定正确，并且能在大肠杆菌中表达，表明质粒pBK760成功插入pMD20载体中，嗜水气单胞菌穿梭质粒pBKPU01构建成功。

关键词：嗜水气单胞菌；质粒pBK760；穿梭质粒载体；表达中图分类号：Q784文献标志码：A 江苏科技信息Jiangsu Science &Technology Information基金项目：江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目；项目编号：201912682012Y 。

盐城市医学科技发展计划项目；项目编号：YK2016048。

作者简介：张莉（1996—），女，江苏盐城人，本科生；研究方向：微生物药学。

引言嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌［1］，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌［2］，嗜水气单胞菌的变异菌株较多，多数菌株对氟哌酸、菌必治敏感，嗜水气单胞菌表现多种抗性［3］，其中一个主要原因是含有多种质粒［4］。

本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒，命名为质粒pBK760，该质粒具有多种位点和抗性，具有良好的载体特征。

pMD20是一种高效克隆PCR 产物的专用载体［5］。

该载体以pUC19载体为基础，在其多克隆位点处的Xba I 和BamH I 位点之间增加了Spe I ，Nde I ，EcoR V3种酶切位点，经EcoR V 酶切后再在两侧的3’端添加“T ”制备而成［6］。

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法：1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。

2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃，220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。

注意：接种比例不得大于1:10。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。

4、4℃ 5000g离心5分钟。

用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟；6、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。

分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。

含15%甘油的0.05mol/L CaCl2制备方法:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA的状态。

感受态细胞的特征：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。

（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。