脉冲场凝胶电泳(PFGE)

脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。

它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。

PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。

2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。

3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。

4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。

总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。

pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。

该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。

下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。

1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。

可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。

选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。

2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。

将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。

b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。

在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。

c. 让凝胶固化。

根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。

3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。

将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。

b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。

确保尽量避免气泡进入凝胶槽。

c. 启动电泳。

电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。

启动电源，并将电流设置为所需的值。

4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。

常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。

b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。

这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。

5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。

b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。

6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。

b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。

脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，该技术是将电泳电场方向交替性改变，并优化脉冲时间和其他条件，可以分辨凝胶中35～10 000 kb的DNA分子。

该方法应用于分子流行病学中，通过观察电泳条带的差异，为确定菌株之间的亲缘关系提供了可靠的技术手段。

该技术在致病菌溯源（细菌性传染性疾病溯源、细菌性食源性疾病溯源）、医院内感染流行监测等方面都有广泛的应用。

标签：脉冲场凝胶电泳；致病菌分型；致病菌溯源；院感监测[Abstract] Pulsed Field Gel Electrophoresis （PFGE）is a new technique of gelelectrophoresis developed in1980’s. It can be used to separate large DNA molecules ranging from 35 to10 Mb. It has been widely applied to the pathogen molecular typing ，identification of species groups ，Source-tracking of pathogen and nosocomial infection surveillance.[Key words] PFGE；Pathogen molecular typing；Traceability pathogens；Hospital infection surveillance脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，是上世纪80年代后期发展起来的一种新型的电泳技术，主要用来分离大分子量线性DNA。

传统的琼脂糖凝胶电泳技术仅能分离50 kb以下的DNA分子，对于超过50 kb的DNA分子，传统的琼脂糖凝胶其分子筛作用较弱，无法清晰分辨电泳条带[3]。

脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。

而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。

图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A、B代表两个交替开启和关闭的电场。

当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。

可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。

1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。

首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。

PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。

在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。

在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。

一次分离过程通常持续16小时以上。

2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。

（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。

（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。

3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。

（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。

（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。

总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。

通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。

8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。

脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。

该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。

其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。

脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。

而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。

图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。

当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。

可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。

该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。

在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。

DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。

这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。

实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。

接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。

带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。

根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。

需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。

但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。

脉冲交变电场凝胶电泳脉冲交变电场凝胶电泳（PulseFieldGelElectrophoresis，简称PFGE）是一种常用的分子印迹技术，可以分析出微生物类群的分子细胞分子量和电泳结构。

PFGE是由威廉S克莱因爵士（William S. Klein）于1989年发明的，也是当今最为重要的遗传技术之一。

它利用了由一个或多个可改变的电场来引导DNA链在凝胶电泳中运动，这种可改变的电场交替变化，称为脉冲(Pulse)。

PFGE首先使用聚合物凝胶将所要分析的DNA片段缓慢拉伸，然后将拉伸的DNA片段注入凝胶电泳板。

在凝胶电泳过程中，DNA片段会被拉伸，形成一条宽的“蛇形”DNA条带，可以被精确测定。

脉冲场电泳技术将电场脉冲应用到凝胶电泳中，可以改变凝胶电泳速度，使DNA片段在凝胶中移动，从而分离出小片段，有利于进一步改善结果的质量和精确度。

PFGE技术可以分离出不同的DNA片段，可以用来评估微生物的分子多样性、物种的分子变异和群体的遗传多样性。

它可以用于研究病原体的分子结构和多样性，包括疾病的基因分型、抗药突变类型等，也可以用于家系遗传研究、基因库构建、病毒检测等。

PFGE技术可以以高精度、快速、简便的方式，实现病原体和分子结构的高精度分析，是病原体研究比较可靠的技术。

此外，PFGE技术还可以用于肿瘤基因突变检测、遗传学计算机模拟和基因芯片验证等，它可以提供快速、精确、可靠的分子诊断，更有利于科学家们认识病毒、病原体和细胞免疫力的结构。

脉冲交变电场凝胶电泳的关键技术，主要是电泳温度的控制和脉冲电场的调制，使之能够实现精准的DNA分离。

首先，PFGE实验仪会将温度保持在室温的一定程度，使得DNA能够在芯片凝胶中热性解析，实现最佳的分离结果。

其次，PFGE设备还需要使用脉冲交变电场电泳分离DNA片段，将电场脉冲应用到凝胶电泳中。

这样，就可以有效防止微生物病毒的拉伸，改善凝胶电泳结果的质量和精确性。

PFGE技术已经广泛应用于预防医学、兽医学和细胞遗传学的众多领域。

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%4ESP缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，Img/mL蛋白酶K。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5匕g/mL溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。

脉冲电场凝胶电泳及其应用脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，简称PFGE）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，广泛应用于基因组学、分子流行病学和疾病诊断等领域。

本文将介绍脉冲电场凝胶电泳的原理、实验步骤以及其在不同领域的应用。

一、原理脉冲电场凝胶电泳是基于传统凝胶电泳的基础上发展起来的一种技术。

其原理是利用不同方向的电场脉冲交替作用于DNA分子，使得DNA在凝胶中的运动方向改变，从而提高了分离效果。

在脉冲电场凝胶电泳中，常用的凝胶材料是琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。

DNA样品首先经过酶切或限制性内切酶切割，然后将切割后的DNA片段进行电泳分离。

脉冲电场通常是由两个方向的电场脉冲交替作用产生的，这样就使得DNA在凝胶中呈现交错状的运动轨迹。

通过调整电场的强度和方向，可以实现对DNA片段的高效分离。

二、实验步骤脉冲电场凝胶电泳的实验步骤包括样品制备、琼脂糖凝胶制备、电泳条件设置和电泳结果分析等。

1. 样品制备：将待测DNA样品进行切割或限制性内切酶切，得到DNA片段。

2. 琼脂糖凝胶制备：将琼脂糖加热至溶解，然后冷却至约60°C左右，加入缓冲液和DNA样品，混合均匀后倒入电泳槽中。

3. 电泳条件设置：根据实验需要，设置电场的强度和方向。

通常情况下，电场强度为6 V/cm至8 V/cm，电泳时间为16小时至20小时。

4. 电泳结果分析：将凝胶取出，进行染色或杂交等处理后，通过紫外光照射或激光扫描等方式观察和记录DNA分子的迁移情况。

三、应用脉冲电场凝胶电泳在基因组学、分子流行病学和疾病诊断等领域具有广泛的应用。

1. 基因组学：脉冲电场凝胶电泳可用于基因组的拓扑结构研究、基因重排分析、基因突变检测等。

例如，通过脉冲电场凝胶电泳可以分析染色体的大小、数目和结构等信息，从而揭示基因组的组织和功能。

2. 分子流行病学：脉冲电场凝胶电泳可以用于病原微生物的分子流行病学研究。

BN软件分析PFGE脉冲场凝胶电泳（PFGE）是一种高度区分性的分子分型技术，是一种分离大分子DNA或者染色体的方法。

PFGE是基于大的DNA限制性片段在交替极性的电场中的可变迁移的原理。

在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。

DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。

相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。

因此小分子向前移动的速度比大分子快。

然后通过比较任何两个分离株的指纹图谱，可以研究它们是否属于同一菌株（即两个分离株是克隆的）或在遗传上不相关。

PFGE在国际监测网络（例如PulseNet）中的使用以及在重要食源性病原体（大肠杆菌，李斯特菌，弯曲杆菌等）的标准流程中的使用，促进了该技术的采用。

尽管可以使用最新的分型方法，但PFGE仍然是许多国家和国际监测程序中的金标准。

在实践中，将经过研究的分离株的标准化细胞悬液包埋在琼脂中，以增强该过程中的DNA稳定性。

然后裂解细菌细胞，并通过宏观限制性分析产生细菌染色体的大片段。

在电泳过程中使用交替极性的电场分离DNA片段，然后得到图谱并记录指纹文件。

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在各种聚类分析方法之间进行选择：UPGMA、Ward、邻位相邻、单链接、完整链接、创建图。