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脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。
其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。
具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。
本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。
1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。
PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。
之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。
根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。
基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。
2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。
如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。
如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。
而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。
考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。
3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。
缓冲液的温度会产生一定的影响。
这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。
在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。
脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。
细菌分子分型技术服务(PFGE/MLVA/MLST)一、产品描述信息过去20年的实践证明，分子分型方法在细菌的分子流行病学、种群结构分析、基因多态性分析等方面显示了很好的应用能力，在疾控、医药、农业、食品、环境、出入境检验检疫等领域发挥重要作用。
其中脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）三种技术是目前应用最广泛的细菌分子分型方法。
PFGE以其重复性好，分辨力强而被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。
它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb。
PFGE选用识别低频率酶切位点的内切酶切割基因组DNA，获得的DNA大片段在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离，产生数量有限的DNA条带，在凝胶上按染色体片段长度的不同而呈现出电泳带型，从而实现对菌株分型以检测菌株的基因多态性。
MLST是基于细菌核苷酸序列比对的一种分子分型方法，其原理是通过比较细菌个体7个或者更多管家基因的核苷酸序列的多态性，确定其基因多态性，同时通过划分序列群和构建最小生成树来揭示细菌群体遗传结构。
MLVA是基于细菌基因组中多个位点的数目可变化的串联重复序列核心序列的拷贝数的差异来对不同细菌个体进行分型的一种技术。
MLVA具有快速高通量易于操作等优点，不仅能确定基因多态性，而且能揭示细菌群体遗传结构特征。
使用PFGE、MLST、MLVA中的一种或者综合使用多种分型方法，可以揭示细菌的基因多态性和群体遗传结构，结合细菌的三间分布信息以及其他生物学信息（如耐药特征、特殊表型、毒力基因检测）等可以进行细菌的流行特征、传播机制、变异特征分析，以及特殊意义克隆群的甄别等研究，另外还可以为后续的研究，如全基因组测序、致病机制研究等项目筛选具有基因组代表性的测试菌株。
二、产品详细信息1、技术路线2、技术优势1.技术成熟，本团队具有丰富的实践经验，可为客户提供详细先进的实验方案；2.有多种分型方法组合供不同的实验目的选择；3.性价比高，适合开展大样本量的实验项目；4.快速高效，只需一个月时间可以完成100株细菌的基因多态性和种群结构分析。
脉冲电泳原理脉冲电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE）是一种高分辨率的电泳技术，广泛应用于DNA分子的分离和分析。
它利用交替的电场方向和不同频率的电场脉冲，能够有效地分离大分子DNA，是分子生物学领域中重要的实验方法之一。
脉冲电泳的原理基于DNA分子在电场中的迁移速度与其大小成反比的关系。
在传统的连续电泳中，较大的DNA片段会受到较大的电阻力而难以迁移，导致分辨率较低。
而脉冲电泳通过交替改变电场方向和频率，使得DNA分子有机会在电场中重新定位，从而能够有效地分离不同大小的DNA片段。
在进行脉冲电泳实验时，首先需要将待分离的DNA样品嵌入凝胶中，通常使用琼脂糖或琼脂糖瓷作为凝胶材料。
接下来，将凝胶放置在电泳槽中，注入含有缓冲液的电泳缓冲液。
然后，施加高压电场，使得DNA分子在凝胶中迁移。
在脉冲电泳中，电场的方向和频率会不断变化，从而使得不同大小的DNA片段能够得到更好的分离。
脉冲电泳的优势在于其高分辨率和对大分子DNA的有效分离。
通过调整电场的方向和频率，可以实现对不同大小DNA片段的精确分离，使得实验结果更加准确可靠。
因此，脉冲电泳被广泛应用于基因组学研究、疾病诊断、DNA指纹分析等领域。
总的来说，脉冲电泳是一种重要的分子生物学实验技术，其原理基于DNA分子在电场中的迁移速度与大小成反比的关系。
通过交替改变电场方向和频率，脉冲电泳能够有效地分离大分子DNA，具有高分辨率和高效性的优势。
在实验过程中，需要注意凝胶的制备和电场参数的调节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
脉冲电泳在基因组学研究、疾病诊断、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用前景，对于推动生命科学研究具有重要意义。
凝胶电泳问题
凝胶电泳是一种常见的生物学实验技术，用于分离和检测DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的方法。
在使用凝胶电泳时，可能会遇到以下一些常见问题：
1. 凝胶溶液凝固不均匀：可能是因为搅拌不均匀导致，解决方法是在配制凝胶溶液前彻底搅拌混合。
2. 凝胶电泳速度过快或过慢：速度过快可能是电压设置过高，速度过慢可能是电压设置过低。
解决方法是调整电压使其达到合适的电泳速度。
3. 凝胶溶液漏出：可能是凝胶支架或腔室密封不好，解决方法是检查密封性并进行修复。
4. 杂散电流影响结果：可能是电泳槽中存在污染物导致的，解决方法是彻底清洗电泳槽和电极。
5. 电泳结果模糊或不清晰：可能是取样量不足或带电物质浓度过高，解决方法是调整取样量或稀释样品。
6. 凝胶溶胀或收缩：可能是凝胶制备过程中的化学物质失衡导致的，解决方法是检查凝胶制备过程中的化学物质配方和试剂质量。
如果遇到以上问题可以根据具体情况逐一排查，寻找解决方法。
另外，凝胶电泳是一项常见的实验技术，也可以向实验室的同事或专家咨询，以获取更准确的解决方案。
脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。
PFGE注意事项：：蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。
冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。
电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为:细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。
McClelland等[8]通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。
同样地,在许多含Ｇ+Ｃ<45%的基因组,CCG和CGG更少。
这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。
而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。
图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A、B代表两个交替开启和关闭的电场。
当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。
可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
此外还发现，当交替变化的两个电场方向的夹角大于90°时，DNA能较迅速地将其后端调转过来，在新的电场中成为泳动的前端。
但另一方面，于DNA 分子是顺长度穿越凝胶孔的，当电场方向突然改变时，分子的两端可能同时伸入不同的凝胶孔，折为U形或J形结构而被阻隔下来。
只有当新的前端移向更前方时，另一端才能被牵拉下来。
因DNA 分子具有很大弹性，当某一端挂在凝胶孔时，DNA分子拉长，滑落下来后又收缩，并很快赶上前端。
但当电场强度太大时，大分子DNA因带有均匀的电荷，电场力的作用将可能使同一DNA大分子的多个部位同时进入多个凝胶孔，结果被陷住而不再向前移动。
这就是在分离人酵母菌(S．pombe)染色体等大分子时要用低电场的原因。
二PFGE 在分子生物学中的应用PFGE是一种非常有效的分子分型方法。
在国外被广泛应用于很多菌种的分子流行病学研究中。
能够用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源，在疫情控制方面可发挥重要的作用。
具体表现在以下几个方面： 1 研究菌株之间的遗传差异。
2 在表面上散在分布的病例中寻找可能的联系，通过监测及时发现暴发。
当今传染病暴发流行的性质发生了改变，即：暴发流行不再局限于某一地区，一段相对集中的时间里，同一污染源引起的暴发流行，而是多个传染源．在较长的时间段内，跨越省市甚至是国家的暴发流行。
脉冲场凝胶电泳方法于其自身优势而被广泛应用于追踪监测细菌传染性疾病的暴发流行，还有助于识别散发病例的传染源。
3 可用于对已确认的爆发疫情进行传染源的追踪，从而有效预防疫情的再次发生。
4 除了帮助流行病学调查外．细菌分型还能对病人的诊断和治疗提供线索，对连续继发性感染患者分离菌株进行PFGE分析可以区分是复发(单一菌株型)还是新的菌株引发的再感染。
5 PFGE也用于抗生素敏感株和多重耐药菌株的分子分型，如耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌和耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)。
6 对生活环境中分离的菌株和病人中分离菌株进行相关性分析。
7 PFGE还可用于其他领域，如百日咳抗原性变异和PFGE的相关性。
三、脉冲场凝胶电泳的方法高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。
置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。
2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。
3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。
4．用PBS 重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6．将等体积细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。
7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。
每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。
9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或/L EDTA 溶液中保存于4℃。
10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。
11．将凝胶块放入装有TE及/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。
12．室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用/L EDTA，4℃保存凝胶块。
13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。
大小标准物的制备1）λ多联体1．以TE缓冲液悬浮λ多联体，浓度为4μg/40μl。
2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖混匀。
3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。
2）酵母染色体1．从YPD培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h。
2．4000×g 转速，离心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl()溶液悬浮。
3．仍以4000×g转速离心10min，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，/L枸椽酸钠，及10 mmol/L EDTA ()]溶液重悬。
4．取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。
5．溶液短暂离心后，再用SCE重悬细胞，使40μl SCE溶液中含5×107个细胞。
6．溶液与/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巯基乙醇混匀，37℃保温15～30min。
7．细胞悬液与等体积的SCE配制的2％低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在50℃。
8．将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。
9．凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37℃下振荡温育1～2小时。
10．将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50℃温育48h。
11．用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl()溶液洗涤凝胶块3次，每次20min。
12．凝胶块可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。
琼脂糖凝胶块中DNA的限制性内切酶消化1．应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA 降解。
2．在Falcon试管中用1×TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA。
3．混合：酶反应缓冲液，100 mmol/L亚精胺，10～20单位的内切酶。
20单位的内切酶就足以过夜完全消化10μg DNA。
4．设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA降解。
5．将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。
6．若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化。
倘若首次消化的酶要求50℃条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。
7．若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1：10稀释的酶进行尝试。
凝胶电泳1．将％的琼脂糖在×TBE中熔化后冷却至50～60℃，立即注入凝胶框架中，并插入梳子2．凝胶固化后小心地拔出齿梳，用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。
若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。
将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。
3．用1％液态低熔点琼脂糖凝胶密封狭槽。
4．若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。
5．一旦密封的低熔点琼脂糖已固化，可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。
6．应设定合适的电压及转换时间并开始电泳。
两个不同电泳方向的电流应相等。
7．电泳结束后，凝胶用×TBE配制成的EB染色。
8．用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。
9．凝胶成像：DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。
10．用/L HCl漂洗凝胶30min，让DNA脱嘌呤，并有利于转移。
11．凝胶用碱变性20min，两次，续以中性溶液1～5min。
12．采用标准Southern印迹方案将DNA转印至尼龙膜上。
一般来说，印迹PFGE凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长四、脉冲场凝胶电泳的分类1．InCert琼脂糖----兆碱基片断DNA制备获准使用的琼脂糖。
是一种极为有用的制备脉冲场凝胶电泳用染色体DNA样品的低胶凝温度琼脂糖。
研究证实InCert琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA的制备和限制性核酸内切酶消化。
⊙应用：脉冲场凝胶电泳。
⊙分析说明：胶凝温度：26℃-30℃硫酸盐：≤% 凝胶强度(%)：≥400g/cm 2 熔化温度：≤70℃湿度：≤10% EEO(-Mr)：≤ 2．SeaKem Gold琼脂糖是一种高凝胶强度，低EEO，标准胶凝温度的琼脂糖。
这种遗传学术级别琼脂糖最适于脉冲场凝胶电泳法快速分辨Mb DNA和常规电泳方法分辨1-50kb的DNA与PCR产物。
因其低EEO特性，SeaKem Gold琼脂糖中的DNA电泳迁移速度要显著的高于常规琼脂糖凝胶。
PFGE的跑胶时间依使用的缓冲液和琼脂糖浓度的不同可减少至原电泳时间的50%。
因其高凝胶强度，即使是使用低浓度的SeaKem Gold琼脂糖凝胶，操作处理依然很方便，从而允许在常规电泳中分离更大的DNA片断并减少PFGE中的DNA分离的耗时。
⊙应用：脉冲场凝胶电泳；标准凝胶电泳分离大于23kb的DNA片断；Mb大小DNA印迹。
⊙分析说明：胶凝温度:℃－℃硫酸盐：≤% 凝胶强度(%)：≥1800g/cm2凝胶强度：≥3500g/cm2 湿度：≤10% EEO(-Mr)：≤ 五PFGE结果的解释Tenover等提出了有关菌株同源性的判别标准，按其电泳条带可分为：无差异，说明为相同菌株；有1～3条带的差异说明菌株间有相近关系，且只有单基因的改变；4～6条带的差异说明菌株间可能有相近关系，表示出有两个独立基因的差异；如菌株间有6条带或更多条带差异，说明有三个或更多基因的变化，被视为无相关性。
