脉冲场凝胶电泳技术_PFGE_在分子分型中的应用现状_王丽丽

脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。

它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。

PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。

2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。

3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。

4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。

总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。

pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。

该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。

下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。

1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。

可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。

选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。

2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。

将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。

b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。

在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。

c. 让凝胶固化。

根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。

3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。

将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。

b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。

确保尽量避免气泡进入凝胶槽。

c. 启动电泳。

电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。

启动电源，并将电流设置为所需的值。

4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。

常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。

b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。

这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。

5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。

b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。

6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。

b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。

脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，该技术是将电泳电场方向交替性改变，并优化脉冲时间和其他条件，可以分辨凝胶中35～10 000 kb的DNA分子。

该方法应用于分子流行病学中，通过观察电泳条带的差异，为确定菌株之间的亲缘关系提供了可靠的技术手段。

该技术在致病菌溯源（细菌性传染性疾病溯源、细菌性食源性疾病溯源）、医院内感染流行监测等方面都有广泛的应用。

标签：脉冲场凝胶电泳；致病菌分型；致病菌溯源；院感监测[Abstract] Pulsed Field Gel Electrophoresis （PFGE）is a new technique of gelelectrophoresis developed in1980’s. It can be used to separate large DNA molecules ranging from 35 to10 Mb. It has been widely applied to the pathogen molecular typing ，identification of species groups ，Source-tracking of pathogen and nosocomial infection surveillance.[Key words] PFGE；Pathogen molecular typing；Traceability pathogens；Hospital infection surveillance脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，是上世纪80年代后期发展起来的一种新型的电泳技术，主要用来分离大分子量线性DNA。

传统的琼脂糖凝胶电泳技术仅能分离50 kb以下的DNA分子，对于超过50 kb的DNA分子，传统的琼脂糖凝胶其分子筛作用较弱，无法清晰分辨电泳条带[3]。

脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。

而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。

图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A、B代表两个交替开启和关闭的电场。

当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。

可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。

其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。

具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。

本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。

1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。

PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。

之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。

根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。

基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。

2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。

如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。

如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。

而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。

考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。

3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。

缓冲液的温度会产生一定的影响。

这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。

在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。

脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。

细菌分子分型技术服务(PFGE/MLVA/MLST)一、产品描述信息过去20年的实践证明，分子分型方法在细菌的分子流行病学、种群结构分析、基因多态性分析等方面显示了很好的应用能力，在疾控、医药、农业、食品、环境、出入境检验检疫等领域发挥重要作用。

其中脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）三种技术是目前应用最广泛的细菌分子分型方法。

PFGE以其重复性好，分辨力强而被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。

它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb。

PFGE选用识别低频率酶切位点的内切酶切割基因组DNA，获得的DNA大片段在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离，产生数量有限的DNA条带，在凝胶上按染色体片段长度的不同而呈现出电泳带型，从而实现对菌株分型以检测菌株的基因多态性。

MLST是基于细菌核苷酸序列比对的一种分子分型方法，其原理是通过比较细菌个体7个或者更多管家基因的核苷酸序列的多态性，确定其基因多态性，同时通过划分序列群和构建最小生成树来揭示细菌群体遗传结构。

MLVA是基于细菌基因组中多个位点的数目可变化的串联重复序列核心序列的拷贝数的差异来对不同细菌个体进行分型的一种技术。

MLVA具有快速高通量易于操作等优点，不仅能确定基因多态性，而且能揭示细菌群体遗传结构特征。

使用PFGE、MLST、MLVA中的一种或者综合使用多种分型方法，可以揭示细菌的基因多态性和群体遗传结构，结合细菌的三间分布信息以及其他生物学信息（如耐药特征、特殊表型、毒力基因检测）等可以进行细菌的流行特征、传播机制、变异特征分析，以及特殊意义克隆群的甄别等研究，另外还可以为后续的研究，如全基因组测序、致病机制研究等项目筛选具有基因组代表性的测试菌株。

二、产品详细信息1、技术路线2、技术优势1.技术成熟，本团队具有丰富的实践经验，可为客户提供详细先进的实验方案；2.有多种分型方法组合供不同的实验目的选择；3.性价比高，适合开展大样本量的实验项目；4.快速高效，只需一个月时间可以完成100株细菌的基因多态性和种群结构分析。

脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。

而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。

图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。

当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。

可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。

该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。

在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。

DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。

这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。

实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。

接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。

带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。

根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。

需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。

但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。

ERIC-PCR与PFGE检测铜绿假单胞菌同源性的方法学比较孙晶;常军霞;刘巍【摘要】目的比较肠杆菌基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)与限制性内切酶联合脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测铜绿假单胞菌同源性的方法学一致性.方法分别用ERIC-PCR和PFGE对北京某医院48株铜绿假单胞菌株进行分型,明确其是否有克隆传播.结果 ERIC-PCR方法鉴定有34株为同一克隆来源,其余14株被分为9种基因型.PFGE方法分型鉴定有38株为同一克隆来源,其余10株表现为7种基因型,均提示脑外科内的铜绿假单胞菌在2010年存在一个克隆株传播.两种方法学结果的符合率为89.5％,PFGE重复3次结果相似度达96.6％,ERIC-PCR重复5次结果相似度达75.4％.结论 ERIC-PC操作简便快速,重复性较好,与PFGE结果一致性高,适合在基层医院进行细菌流行病学分析.%Objectives Compare the methodology consistency of PFGE and ERIC-PCR used in Pseudomonas aeruginosa homology detection. Methods Pulse-field gel electrophoresis (PFGE) and Enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR) were performed respectively to detect molecular features of 48 pan-drug resistant Pseudomonas aeruginosa strains. Results In all, 34 strains were proved to be the same clone by ERIC-PCR, and the other strains were identified into 9 types; 38 strains were presented the same clone by PFGE, and the rest were classified into 7 types. The results showed that the same cloning strain was emerged in department of cerebral surgery in 2010. The coincidence rate of the two methods was 89.5%. PFGE had three repetitions, and the similarity was 96.6%; ERIC-PCR had five repetitions, and the similarity was 75.4%. Conclusion ERIC-PCR, with rapiddetection, good reproducibility and high consistency with PFGE, is easy and simple to handle. It is suitable for bacterial epidemiological analysis in primary hospital.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2013(038)004【总页数】6页(P297-302)【关键词】铜绿假单胞菌;脉冲场凝胶电泳;肠杆菌基因间重复一致序列PCR【作者】孙晶;常军霞;刘巍【作者单位】北京市通州区潞河医院,北京101149【正文语种】中文【中图分类】R378.99+1铜绿假单胞菌是条件致病菌，可引起医源性感染及医院内获得性肺炎。

1例孕妇感染李斯特菌病例的病原学分析及分子特征研究王丽丽;陈倩【期刊名称】《首都公共卫生》【年(卷),期】2016(010)003【摘要】目的对北京市1名孕妇感染单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes,Lm)病例进行病因食品溯源、病原学检测、血清学分型、耐药及分子特征研究.方法对流行病学相关的1株孕妇病例Lm分离株和1株可疑食品Lm分离株进行血清型分型及脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分子分型,并采用CLSI和EUCAST推荐的微量肉汤稀释法检测菌株对12种抗生素的敏感性.结果 2株Lm分离株均为1/2a血清型,药敏结果一致,对有国际标准的青霉素、氨苄西林、复方新诺明及红霉素敏感,其他8种抗生素的MIC值均较小,经Asc Ⅰ酶切后具有100％同源的PFGE指纹图谱带型.结论结合流行病学调查、实验室病原学检测、药敏和PFGE分子分型结果,高度怀疑本例孕妇感染李斯特菌病例是由进食受1/2a血清型单核细胞增生李斯特菌污染的牛肉三明治所致.【总页数】4页(P103-106)【作者】王丽丽;陈倩【作者单位】100013,北京市疾病预防控制中心/食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室;100013,北京市疾病预防控制中心/食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R517.7【相关文献】1.3例单增李斯特菌感染的病原学、临床及流行病学特征分析 [J], 王红;王艳;张正东;陈曦;邓建平;肖波;刘祥;王斌;文海2.2010～2014年郴州市手足口病重症和死亡病例的流行病学及病原学特征研究[J], 朱韩武;谭徽;李成华;刘爱平;谢群;付敏;段良松3.葫芦岛市2012-2015年流感样病例流行病学特征研究与病毒病原学调查 [J], 李德强;李明月;沈铁峰;黄德生;关鹏4.2016年福建省单核细胞增生李斯特菌临床病例及食品来源菌株的分子特征分析[J], 陈伟伟;吴晓敏;廖冬冬;曾妍;郑盈翔5.临沂市2014-2019年单增李斯特菌感染病例流行病学调查和PFGE分子分型分析 [J], 蒋海英;左亚凡;王济忠;季圣翔;李涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

脉冲电场凝胶电泳及其应用脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，简称PFGE）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，广泛应用于基因组学、分子流行病学和疾病诊断等领域。

本文将介绍脉冲电场凝胶电泳的原理、实验步骤以及其在不同领域的应用。

一、原理脉冲电场凝胶电泳是基于传统凝胶电泳的基础上发展起来的一种技术。

其原理是利用不同方向的电场脉冲交替作用于DNA分子，使得DNA在凝胶中的运动方向改变，从而提高了分离效果。

在脉冲电场凝胶电泳中，常用的凝胶材料是琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。

DNA样品首先经过酶切或限制性内切酶切割，然后将切割后的DNA片段进行电泳分离。

脉冲电场通常是由两个方向的电场脉冲交替作用产生的，这样就使得DNA在凝胶中呈现交错状的运动轨迹。

通过调整电场的强度和方向，可以实现对DNA片段的高效分离。

二、实验步骤脉冲电场凝胶电泳的实验步骤包括样品制备、琼脂糖凝胶制备、电泳条件设置和电泳结果分析等。

1. 样品制备：将待测DNA样品进行切割或限制性内切酶切，得到DNA片段。

2. 琼脂糖凝胶制备：将琼脂糖加热至溶解，然后冷却至约60°C左右，加入缓冲液和DNA样品，混合均匀后倒入电泳槽中。

3. 电泳条件设置：根据实验需要，设置电场的强度和方向。

通常情况下，电场强度为6 V/cm至8 V/cm，电泳时间为16小时至20小时。

4. 电泳结果分析：将凝胶取出，进行染色或杂交等处理后，通过紫外光照射或激光扫描等方式观察和记录DNA分子的迁移情况。

三、应用脉冲电场凝胶电泳在基因组学、分子流行病学和疾病诊断等领域具有广泛的应用。

1. 基因组学：脉冲电场凝胶电泳可用于基因组的拓扑结构研究、基因重排分析、基因突变检测等。

例如，通过脉冲电场凝胶电泳可以分析染色体的大小、数目和结构等信息，从而揭示基因组的组织和功能。

2. 分子流行病学：脉冲电场凝胶电泳可以用于病原微生物的分子流行病学研究。

2020大肠杆菌的分型方法及其研究进展肠埃希氏菌是一种条件性致病菌，致病性的大肠埃希氏菌具有高度的传染性，会严重危害健康。

快速准确地测定大肠埃希氏菌的污染来源对有效缩小疫情影响范围极有帮助，从而避免对人类健康和经济贸易造成重大损失。

建立简便高效的分型方法是微生物溯源的关键，常见的大肠埃希氏菌分型方法可分为表型分型和分子分型，这些分型方法各有优劣，具有不同的适用范围。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli)又称大肠杆菌，属革兰氏阴性菌，于1885年首次被发现[1]，是人和动物体内的正常寄居菌。

大肠埃希氏菌是一种条件致病菌，在正常情况下不致病，然而一些特殊血清型菌株可导致人或动物腹泻、腹痛甚至会产血性粪便，重症病例会并发溶血性的尿毒综合征以及血小板减少性紫癜[2-3]。

根据大肠埃希氏菌对人类的致病机理不同，可将其分为5种类型：.肠致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic escherichia coli，EPEC).肠产毒性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic escherichia coli，ETEC).肠侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive escherichia coli，EIEC).肠出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic escherichia coli，EHEC) .肠集聚性大肠埃希氏菌(Enteroaggregative escherichia coli，EAEC) 大肠埃希氏菌的肠道传染具有比较广泛的特性，而食品在生产、包装及运输过程中极易感染此菌，进而引发传染性疾病[5]。

2018年6月，大肠埃希氏菌O157:H7污染生菜事件的暴发，影响了美国36个州，事件造成96人住院和5人死亡[6]。

2019年4月，美国的10个州暴发牛肉感染大肠埃希氏菌O103事件，导致177人感染，其中21人住院，涉事公司紧急召回了53 200磅牛肉[7]。

动物医学进展,2008,29(1):70273Progress in Veterinary Medicine脉冲场凝胶电泳技术在猪链球菌分型中的应用3聂小想1,2,沈志强2,崔言顺1,逄　媛1,2,管　宇2,沈　旭2(1.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018;2.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600) 摘　要:脉冲场凝胶电泳是一种可用于分离20kb至10Mb大分子质量DNA的新型凝胶电泳技术。

该法应用于猪链球菌的分子分型,通过观察电泳条带的差异,为确定菌株之间的亲缘关系,分析基因型和临床症状之间的关系等方面提供了可靠的技术手段。

文章介绍了脉冲场凝胶电泳技术的应用状况及猪链球菌的分型现状,并阐述了该技术在猪链球菌分子分型研究方面的应用及发展前景。

关键词:脉冲场凝胶电泳;猪链球菌;基因分型;应用中图分类号:S852.611;S858.28文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0120070204 猪链球菌(St reptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原,它可导致断乳期和生长期猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎及猝死,在猪群中有较高的流行性。

人一旦被感染,后果比较严重。

早在1968年荷兰和丹麦就有报道。

根据不完全统计,截止2000年全世界有110例病人,多数来源于北欧和东南亚[1]。

2005年6月在我国四川省资阳、成都等8个地市大面积暴发了猪链球菌病疫情,死亡猪647头,死亡人38例[2]。

开始,由于不熟悉这种细菌,往往被认为是肠球菌、肺炎球菌和牛链球菌等,从而造成误诊。

脉冲场凝胶电泳技术(p ulsed field gel elect rop horesis,PF GE)的出现,促使猪链球病的防治和研究从宏观与微观相结合,推动了分子流行病学的发展,使流行病学者更易追踪该病的传染来源。

本文就PF GE在猪链球菌分型中的应用做一综述。

脉冲电场凝胶电泳1. 介绍脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，简称PFGE）是一种用于分离、检测和鉴定大分子DNA的技术。

它通过在凝胶中施加脉冲电场，利用DNA 分子在电场作用下的迁移速度差异来实现DNA分离。

2. 原理PFGE的原理基于DNA分子在脉冲电场中的迁移速度与其大小有关。

在传统的水平凝胶电泳中，小分子DNA会快速迁移，而大分子DNA由于受到凝胶孔隙限制而迁移较慢。

然而，在一定的时间尺度内，大分子DNA可能无法完全穿过凝胶网络，导致其无法被有效分离。

为了解决这个问题，PFGE引入了脉冲电场。

它通过交替改变电场方向和强度来创造一个“混合模式”，使得大分子DNA能够在不同方向上进行迁移，并最终穿过凝胶网络。

这种方式可以有效地增加大分子DNA的迁移距离，从而实现对大片段DNA 的高效分离。

3. 实验步骤3.1 制备凝胶需要制备PFGE所需的琼脂糖凝胶。

通常使用琼脂糖浓度较高的凝胶（通常为1-2%），以增加凝胶网络的致密程度。

3.2 DNA提取从待检测样品中提取待测DNA。

可以使用常规的DNA提取方法，例如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

3.3 准备DNA样品将提取得到的DNA进行适当的处理和纯化，以去除杂质和降解产物。

可以通过酶处理、有机溶剂萃取或商用纯化试剂盒等方法进行。

3.4 打孔和载入DNA将处理后的DNA溶液加入到琼脂糖凝胶孔中。

为了确保DNA在电泳过程中不会由于重力而下沉，可以在凝胶上方放置一层透明塑料薄膜，并用夹子固定。

3.5 脉冲电场电泳将装有DNA样品的琼脂糖凝胶放置在电泳槽中，并加入适当的缓冲液。

将电泳槽连接到电源上，并设置合适的电场参数，如电压、脉冲时间和脉冲方向等。

3.6 可视化和分析电泳结束后，可以使用DNA染料（如乙溴黄）对凝胶进行染色，并使用紫外线照射仪观察DNA分离结果。

通过比较不同样品的DNA迁移距离和带状图案，可以分析样品中的DNA差异。

肠球菌摘要：肠球菌不像大多数的乳酸菌一样，它不被认为是“安全可靠”（GRAS）。

对于肠球菌的安全评价仍存有争议。

虽然肠球菌被认为是“积极“或在奶酪技术中有用，但它的隔离种群已经作为对人类的条件致病菌出现。

因此，这些细菌对发酵乳制品是否有益处于似是而非的地位，以为它存在有潜在的危险。

本篇综述是概述了肠球菌的积极的和消极的两种特性，并举例说明这个菌的具有争议的特性。

根据食品安全评价准则，我们提出对于每个潜在的技术应变逐个进行评估，并且建议肠球菌在发酵食品中使用前进行个别研究。

1.简介肠球菌最初列为D群链球菌，这种分类可以追溯到由兰斯菲尔德建立的计划。

1984年，肠球菌给予了新的位置被列为肠球菌属，在经过DNA-DNA和DNA-RNA杂交的研究后证明它与链球菌属有较远的关系(Schleifer and Kilpper-Balz, 1984)。

到目前为止32种已被提议列入肠球菌属(http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/ee/Enterococcus.html,2005年10月26号)。

肠球菌种适宜在6.5％氯化钠，40％胆汁盐且pH值在9.6，并可以在60°C的环境下生存30分钟。

大多数品种也可以在10℃至45℃之间生长(Moellering,1992;Flahautet al.,1996)。

粪肠球菌和屎肠球菌都是人类消化道微生物自然存在的菌种，在胃肠道中因为个体差异其含量差异变化很大（在每克消化系统内容物中含有102和108）。

肠球菌通常从食品、植物、水和土壤中分离，可能由于它的来源是粪便使得他们的天性在恶劣环境中比较耐受(Giraffa,2002)。

在牛奶和奶酪制品中通常会找到粪肠球菌、屎肠球菌和少量的坚忍肠球菌，偶然也会发现小肠肠球菌和铅黄肠球菌。

不同于其他乳酸菌，肠球菌不能被认为是“一般认为安全”（GRAS），并且它在水中检测是作为粪便污染物的指标的(Godfree et al.,1997)。

PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程（SOP）PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP)关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型图谱分析：采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。

系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。

第一天一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；2、在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用bioMerieuxVitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。

如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。

5、取400μl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。

将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。

6、从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20μl蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。

7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。

8、在eppendorf管中加入400μl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。

9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。

注意事项：（1）用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。

（2）细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。

（3）在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。

住院患者分离的纹带棒状杆菌回顾性分析摘要：目的了解住院患者分离的纹带棒状杆菌耐药特点及感染现状。

方法分别留取2020年6-9月住院患者标本及环境采样标本中分离的纹带棒状杆菌50株和2株，使用MALDI-TOF MS质谱仪进行鉴定，微量肉汤稀释法进行体外药敏试验，应用Biotyper 3.0软件的聚类分析功能进行菌株同源性分析，对患者病例资料整理汇总。

结果 52株菌株经质谱仪鉴定均为纹带棒状杆菌（Corynebacterium striatum）。

药敏试验显示，50株纹带棒状杆菌对青霉素、头孢吡肟、头孢噻肟、美罗培南、环丙沙星、克林霉素的耐药率>90%，对万古霉素、利奈唑胺的敏感性为100%。

同源性分析表明，老年病科菌株与其他组菌株有明显差异，神经外科呼吸道标本菌株与呼吸机院感采样菌株同源性较高。

结论纹带棒状杆菌在使用广谱抗生素、介入性治疗、长期住院的老年患者中存在感染风险，并可导致交叉感染、院内传播。

关键词：纹带棒状杆菌；耐药性；介入性治疗棒状杆菌属(Corynebacterium)是一群种类繁多的革兰阳性菌，大多为条件致病菌，其中纹带棒状杆菌（Corynebacterium striatum）是一种需氧的无芽孢类白喉棒状杆菌，通常被认为是人体皮肤和黏膜上的正常菌群或者环境菌，长期以来未受到重视[1]。

近年来，随着质谱鉴定及基因测序技术的应用，纹带棒状杆菌的检出率逐渐提高。

国内外研究已经证实，纹带棒状杆菌可引起呼吸道、血液、尿道、皮肤、伤口等常见感染[2，3]，还可引起感染性心内膜炎[4]、硬件相关性感染[5]、化脓性关节炎[6]、骨髓炎[7]等特殊感染，甚至引起患者死亡。

同时，纹带棒状杆菌引起的院感爆发在巴西[8]、比利时[9]、中国[10]、突尼斯[11]等国家均有报道。

本文对2020年6-9月期间住院患者标本中分离的纹带棒状杆菌、院感采样标本菌株及患者病例资料进行回顾性分析，为纹带棒状杆菌的分离鉴定、易感人群、耐药特点、院感控制等积累经验，现报道如下。