BIO-RAD脉冲场电泳介绍

脉冲场电泳仪参数一、技术经济指标1、六角形电极的电泳槽，保证矢量电场的自由旋转，提供更高的分辨率、电泳速度和更精确的分离，对100bp-10Mb的DNA片段都能提供有效的分离。

2、自动演算：提供给用户一套程序用于优化实验参数。

只要输入待分离DNA片段的最小、最大长度，结合10个主要变量的确定，帮助使用者获得最理想的实验条件。

3、脉冲角度：可以在0-360°间自由选择脉冲角度，使用户可以在同一系统上实现大至染色体级、小至质粒DNA的有效分离。

4、时间转换梯度：有线性、非线性（凸形和凹形）两种脉冲时间梯度，非线性梯度可以提供更广泛的分离动态范围，使用户可以精确的确定分离片段的大小。

5、多状态功能：在一个Block中可以有15个电场矢量，每个电场矢量可以有自己的电压和转换时间，可有选择地对一定大小范围的片段进行更精细的分离，并且可以在同一次电泳中实现FIGE和CHEF两种技术。

6、二次脉冲功能：二次脉冲可加速DNA从琼脂糖凝胶中释放，从而有利于非常大的DNA片段的分离，并可提高分辨率。

7、技术应用：CHEF（钳式均衡电场）技术，产生均衡电场；PACE（程序自主控制电极）技术，根据片断大小的需要优化设定脉冲角度；FIGE（电场倒置）技术，为250KB以下小片断DNA提供快速分离；AFIGE（非对称场倒置）技术，精细分离小片断DNA，提高分辨率；以上技术的应用保证了科研人员在所有分子量范围内均能得到所最佳的线性分离。

8、性能指标：a. 电源输出：最高电压350V，0和0.6-9V/cm，0.1V/cm增量，连续可调b. 最大电流：0.5Ac. 延迟启动：最高72小时d. 电极调节能力：动态调节（反馈调整）±0.5％e. 程序储存：存储20个复杂实验程序，每个程序包含8个程序模块或99个简单程序f. 数据记录：键盘，条形码读取或RS-232接口g. 显示屏：2行×40字符/行，荧光显示h. 转换范围：50毫秒到18小时i. 转换角度：0-360°，0.5°增量j. 电泳时间：最高999小时/模块k. 脉冲中断设置：可以通过电压，频率，角度和持续时间设定二、设备产地：国外三、参考品牌及型号：无四、资质要求：4.1投标人需在中华人民共和国境内注册，持有合法有效的企业法人营业执照。

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。

（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。

8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。

脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。

其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。

具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。

本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。

1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。

PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。

之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。

根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。

基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。

2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。

如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。

如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。

而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。

考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。

3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。

缓冲液的温度会产生一定的影响。

这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。

在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。

脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。

细菌分子分型技术服务(PFGE/MLVA/MLST)一、产品描述信息过去20年的实践证明，分子分型方法在细菌的分子流行病学、种群结构分析、基因多态性分析等方面显示了很好的应用能力，在疾控、医药、农业、食品、环境、出入境检验检疫等领域发挥重要作用。

其中脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）三种技术是目前应用最广泛的细菌分子分型方法。

PFGE以其重复性好，分辨力强而被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。

它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb。

PFGE选用识别低频率酶切位点的内切酶切割基因组DNA，获得的DNA大片段在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离，产生数量有限的DNA条带，在凝胶上按染色体片段长度的不同而呈现出电泳带型，从而实现对菌株分型以检测菌株的基因多态性。

MLST是基于细菌核苷酸序列比对的一种分子分型方法，其原理是通过比较细菌个体7个或者更多管家基因的核苷酸序列的多态性，确定其基因多态性，同时通过划分序列群和构建最小生成树来揭示细菌群体遗传结构。

MLVA是基于细菌基因组中多个位点的数目可变化的串联重复序列核心序列的拷贝数的差异来对不同细菌个体进行分型的一种技术。

MLVA具有快速高通量易于操作等优点，不仅能确定基因多态性，而且能揭示细菌群体遗传结构特征。

使用PFGE、MLST、MLVA中的一种或者综合使用多种分型方法，可以揭示细菌的基因多态性和群体遗传结构，结合细菌的三间分布信息以及其他生物学信息（如耐药特征、特殊表型、毒力基因检测）等可以进行细菌的流行特征、传播机制、变异特征分析，以及特殊意义克隆群的甄别等研究，另外还可以为后续的研究，如全基因组测序、致病机制研究等项目筛选具有基因组代表性的测试菌株。

二、产品详细信息1、技术路线2、技术优势1.技术成熟，本团队具有丰富的实践经验，可为客户提供详细先进的实验方案；2.有多种分型方法组合供不同的实验目的选择；3.性价比高，适合开展大样本量的实验项目；4.快速高效，只需一个月时间可以完成100株细菌的基因多态性和种群结构分析。

脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。

而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。

图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。

当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。

可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序生物安全警告：所操作菌为条件致病菌，请按二级生物安全水平操作，转移和操作活菌时更要注意。

处理大量菌株，请在生物安全柜中进行。

以正确方式对接触培养物的塑料制品和玻璃制品进行消毒或丢弃。

开始操作之前，请阅读所有指导。

把所有接触过细胞悬液或凝胶块的塑料制品、玻璃制品、吸管、小铲等当作污染材料，按照实验室的生物要求丢弃或消毒。

可重复使用的制胶模具须在清洗前消毒；可丢弃的制胶模具及胶带和用来把凝胶块从样品孔中推出的小片，应该用10%漂白剂消毒30分钟以上，然后清洗和重复使用。

提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于营养琼脂平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中半固体培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。

37℃培养14-18小时。

第一天1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。

2、用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%Seakem Gold：1%SDS 琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：1）准确称取0.25g SeaKem Gold agarose, 放入250ml的蓝色瓶内。

2）加入22.5ml TE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。

3）微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。

4）将溶解的SeaKem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml，置于56℃水浴箱备用。

3、在Falcon 2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称。

4、在Falcon 2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB（配制方法见附件）。

注：使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同。

德国Biometra的脉冲场电泳系统（Pulsed Field Gel Electrophoresis System）——Rotaphor 6.0版脉冲场电泳系统适用于分离高分子量DNA。

依靠专利的Rotaphor技术，Biometra的脉冲场电泳系统6.0版可分离最高达6,000 kb的DNA；同时，还可轻易地分辨线性和环状的DNA。

新的脉冲场电泳系统6.0版与以前的5.0版相比，不仅在硬件系统上做了较大改进，在控制软件上更是进行了一场革命。

在6.0版本中，整套系统由凝胶室（带旋转电极）、由PC编程和控制的电泳系统、电源盒P25、制冷调节器KH-4（用于外部制冷循环）等组成。

用户除了可以自定义电泳程序外，还可以选用预先储存的、针对不同分子量DNA的程序，并对它进行修改；而且在每一个电泳程序中，都有一幅照片，显示根据这一程序电泳后的实际结果。

由于使用了PC，理论上可以储存足够多的电泳程序。

除此之外，新的电泳室内部还集成了缓冲液循环泵，这样，在进行长时间的电泳时（可长达80小时），确保缓冲液的离子平衡。

Biometra脉冲场电泳系统6.0版技术参数凝胶室由14个铂金电极组成的旋转电极组可以自由旋转，最大角度达270°；内置的缓冲液循环泵；内部冷却回路，接于外置温度控制器；温度敏感探头；最多2.4 L缓冲液；丙烯酸透明玻璃安全盖（当盖子抬起时自动切断电源）；尺寸：35×47×25 cm（W×D×H）。

胶板可调整水平的支脚；20×20cm凝胶尺寸；最大18cm电泳距离；- 2 - 18齿梳子，制胶厚度为5mm 时，最大上样量约为60µl ；可选40齿梳子； 制胶框。

控制器个人计算机；操作系统Win XP ；256M 内存；40G 硬盘；40×光驱；Rotaphor 电泳槽控制界面；预装Rotaphor 6.0控制软件。

Rotaphor 6.0控制软件17组优化程序，可用于分离100bp~6,000kb 的DNA 样品；可根据分离样品类型将电泳程序分类；非常方便地调整各种参数（电极角度、电压、脉冲时间）；电泳电压范围0-225V （0-8.5V/cm ）；电泳缓冲液温度精确控制（5-22℃）；针对每一组电泳程序，都会有相应的实际电泳结果照片显示；用户分组和密码控制；全面的在线帮助；德语或英语界面（正在完成中文化！！）；用户手册。

使用BIO-RAD电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳的操作规范实验原理根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白，在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移速率主要取决于亚基分子量的大小。

实验所用仪器FR-200A全自动紫外与可见分析装置上海复日科技有限公司电泳仪 BIO-RAD公司TS-1型脱色摇床江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司实验用试剂低分子量蛋白Maker TAKARA4*上样缓冲 TAKARAPagn Blue protein staining solution Fermentas试剂的配制1.贮液的配制（1）凝胶储液取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉双丙烯酰胺0.8g ,先用35ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至100ml，过滤。

棕色瓶4℃保存一个月。

（2）1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8)12.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解在80ml双蒸水中，用4mol/l盐酸调PH至8.8。

再用双蒸水稀释至100ml，保存在4℃冰箱。

（3）1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8)6.06g Tris溶解在40ml双蒸水中，用用4mol/l盐酸调PH至6.8。

再用双蒸水稀释至50ml，保存在4℃冰箱。

（4）10%过硫酸铵（APS）0.1g过硫酸铵+1ml双蒸水。

使用前新鲜配制（5）Tris–甘氨酸电泳缓冲液的配制（25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH8.3)）30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS，双蒸水定容至1L。

每次使用时10倍稀释。

（6）样品缓冲液使用4*SDS-PAGE loading buffer(Takara公司)，上样缓冲与样品比例1:3混匀，之后煮沸5min。

2.凝胶的配制注：上表所标体积为配制两块胶的用量。

若配制一块或多块，可按比例减半或加倍。

具体步骤如下：1、样品制备：40 µL蛋白+5*上样缓冲液10 µL，煮沸5 min，冷却后放冰箱下层保存，备用2、制胶1）用专用的医用棉口罩将胶板擦拭干净，电泳槽清洗干净，组装模具。