脉冲场凝胶电泳(PFGE)

脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。

它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。

PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。

2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。

3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。

4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。

总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。

pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。

该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。

下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。

1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。

可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。

选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。

2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。

将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。

b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。

在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。

c. 让凝胶固化。

根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。

3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。

将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。

b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。

确保尽量避免气泡进入凝胶槽。

c. 启动电泳。

电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。

启动电源，并将电流设置为所需的值。

4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。

常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。

b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。

这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。

5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。

b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。

6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。

b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。

大肠杆菌0157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂（TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养14-18小时；用同一个接种针/环,穿刺或接种于小螺帽管中的TSA、HIA或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。

同时接种标准株H9812。

第一天步骤1 细菌的包埋1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。

2、用TE缓冲液（具体试剂配方见附件）制备1%Seakem Gold:1%SDS琼脂糖.以配置25ml体积为例说明,方法如下:1)准确称取0.25g Seakem Gold agarose,放入250ml的蓝盖瓶中.2)加入22.5mlTE缓冲液,轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开.3)微松盖瓶,将玻璃瓶放入微波炉内搞活加热30秒,取出轻柔摇荡,再次加热30秒,重复操作直至琼脂彻底溶解(无颗粒物、悬浮物、透光均一，无明显异常折光，无气泡)4)将溶解的Seakem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml,置于56℃水浴箱备用.3、在Falcon2054管(或其他相当的管)上标记样品名称和空白对照;在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称.4、在Falcon2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB(配方见附件).注:使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同.5、用CSB湿润棉签，从培养皿上刮去适量细菌，均与悬浊于CSB中。

通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。

1）用比浊仪（bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度,并调整浓度至4.0-4.5麦氏单位.2）用分光光度计时,在610nm波长吸光度应在1.3-1.4.3）Dade Microscan Turbidity Meter:0.48-0.52(以Falcon2054管测量) 0.68-0.72(以Falcon2057管测量)注:在 4.0-4.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果,但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异,影响条带的识别.6、取400ul细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中,置于37℃水浴中孵育5分钟.将剩余的细菌悬浊液置于冰上知道胶块制备完毕.7、从水浴箱中取出微量离心管,没管加入20ul蛋白酶K(储存液浓度20mg/ml)混匀,使其终浓度为0.5 mg/ml,蛋白酶K置于冰上备用.8、加入400ul的1%Seakem Gold:1%SDS到上述装有400ul细菌悬液的微量离心管内,用枪头轻轻混匀,避免有气泡产生.(此时1%Seakem Gold:1%SDS需置于56℃水浴中)9、迅速将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固10-15分钟.为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟.10、记录好模具内对应样品的名称。

脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。

该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。

其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。

脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。

而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。

图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。

当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。

可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。

该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。

在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。

DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。

这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。

实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。

接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。

带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。

根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。

需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。

但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%4ESP缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，Img/mL蛋白酶K。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5匕g/mL溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。

浅谈 PFGE实验及注意问题山东济南章丘 250200摘要：目的为达到 PulseNet China 网络实验室监测技术能力标准化和规范化，实现数据有效传输和分析，要求PFGE实验完成的图像要符合质量标准。

方法按照国家疾控中心出台的标准操作规程及结合各网络实验室开展实验以来积累的操作经验。

结果 PFGE实验按操作规程认真、仔细操作，完成的图像就能够达到质量标准。

关键词：PFGE实验；操作规程；注意问题中图分类号：R-331 文献标识码：BPFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）即脉冲场凝胶电泳。

为达到PulseNet China 网络实验室监测技术能力标准化和规范化，实现数据有效传输和分析，要求PFGE实验完成的图像要符合质量标准。

PFGE实验操作步骤繁杂，耗费时间长，要取得标准的分子分型条带，每一步骤均得按操作规程认真操作，同时还得结合操作经验。

PFGE实验主要包括以下步骤：实验前准备工作；细菌培养；制备小胶块；胶块裂解；胶块清洗；酶切；电泳；染色、脱色，读胶成像，现将每一步操作及注意问题简述如下。

1.PFGE实验前准备工作。

1.1制备灭菌纯水：实验用水为水质达到 18.2M 欧的纯水。

所用耗材高压灭菌：配置试剂用螺口瓶，小试管，量筒，枪头。

1.2配制试验用试剂：严格按照操作规程进行配制。

所用试剂有Tris:EDTA Buffer (TE), pH 8.0；Cell Suspension Buffer (CSB)；Cell Lysis Buffer （CLB）；0.5×TBE Buffer；琼脂糖凝胶块(1%SeaKem Gold，以TE 配制)；电泳胶(1% SeaKem Gold，以0.5×TB E 配制)。

1.细菌培养。

2.1如果是冷冻保存的菌株，要复苏后再转种一次，保持该菌株的活力。

PFGE实验用菌株要求在该菌株最佳培养条件下培养14-18小时。

脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。

PFGE注意事项：：蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。

冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。

电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。

脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为:细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。

PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。

McClelland等[8]通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。

同样地,在许多含Ｇ+Ｃ<45%的基因组,CCG和CGG更少。

这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。

对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。

脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。

其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。

具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。

本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。

1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。

PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。

之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。

根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。

基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。

2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。

如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。

如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。

而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。

考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。

3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。

缓冲液的温度会产生一定的影响。

这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。

在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。

脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。

脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。

而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。

图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A、B代表两个交替开启和关闭的电场。

当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。

可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。

1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。

首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。

PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。

在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。

在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。

一次分离过程通常持续16小时以上。

2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。

（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。

（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。

3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。

（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。

（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。

总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。

通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。