基因工程菌培养及其不稳定性

《生物技术制药》课程笔记第一章：绪论一、生物技术的发展史1.1 生物技术概述生物技术是指人们利用微生物、动植物体对物质、能量、信息进行操纵的技术。

它广泛应用于食品、农业、环境保护、能源、医药等领域。

1.2 生物技术的发展简史生物技术的发展可以分为三个阶段：（1）传统生物技术阶段：早在公元前22世纪，中国就开始了酿酒、制酱、制醋等传统生物技术应用。

此后，世界各国也逐渐发展了各自的发酵技术。

（2）现代生物技术阶段：20世纪初，科学家们开始研究酶和微生物，发现了遗传物质DNA和RNA，并逐步揭示了生物体的遗传密码。

这一阶段的代表性成果包括抗生素的发现、遗传工程的创立以及生物制品的生产。

（3）生物技术革命阶段：20世纪70年代末，基因工程技术的发展使生物技术进入了一个新的时代。

基因克隆、基因编辑、基因组学等技术的突破，为生物技术在医药、农业、能源等领域的应用开辟了广阔前景。

二、生物技术药物1.2.1 生物技术药物概述生物技术药物是指利用生物技术方法生产的药物，主要包括蛋白质药物、抗体、疫苗、寡核苷酸药物等。

1.2.2 生物技术药物的特性生物技术药物具有以下特点：（1）高特异性：生物技术药物针对性强，能够精确作用于疾病相关分子。

（2）低毒性：生物技术药物通常来源于自然界中的生物体，毒副作用较低。

（3）复杂性：生物技术药物的结构复杂，生产过程需要严格控制条件。

（4）生产成本高：生物技术药物的生产设备、工艺和原材料成本较高。

三、生物技术制药1.3.1 生物技术制药概述生物技术制药是指利用生物技术方法生产药物的过程。

它主要包括基因工程、细胞培养、蛋白质工程等技术。

1.3.2 生物技术制药特征生物技术制药具有以下特征：（1）生产过程高度自动化、精确化。

（2）药物作用机制明确，针对性强。

（3）生产周期较长，生产成本较高。

（4）药物质量和安全性要求严格。

1.3.3 生物技术在制药中的应用生物技术在制药领域的应用主要包括：（1）生产生物技术药物，如蛋白质药物、抗体、疫苗等。

质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。

工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。

菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。

一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。

如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。

质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。

使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。

质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。

Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。

基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。

基因工程菌的培养
发酵过程：两种菌的混合物的发酵过程
一．工程菌大规模培养的两个关键
1.工程菌的稳定性
不稳定的原因：质粒的不稳定：质粒的丢失
重组质粒发生DNA片段脱落
表达产物的不稳定
工程菌不稳定的因素：培养基的组成（合成培养基有利于宿主细胞的生长，不利
于外源基因的表达）
培养温度（低温有利于重组质粒的稳定遗传）
菌体的比生长速率
控制基因的过量表达
二、溶氧量
溶氧量过低时，说明葡萄糖过量，此时应降低流加速率；当溶氧量过高时，说明葡萄糖即将耗尽，此时应加大流加速率。

当甲醇流速过快时，溶氧量上升：当甲醇流加速率过慢时，溶氧量降低。

三、毕赤酵母
为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。

甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶。

生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。

因此利用醇氧化酶基因作为启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白。

四、重组毕赤酵母具体方法（三段法）
第一阶段：在甘油或葡萄糖为碳源的合成培养基中进行工程菌的分批培养，以累积菌体细胞。

第二阶段：在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培养，以进一步提高菌体量。

第三阶段：即诱导阶段，开始较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。

（要控制甲醇的流加量，浓度高于5g/L时，将会严重抑制细胞的生长。

工程菌传代稳定性方案一、引言随着生物工程技术的不断发展，工程菌的传代稳定性成为一个重要的研究方向。

传代稳定性是指工程菌在持续传代过程中，其基因组和代谢特性不发生显著变化的能力。

传代稳定性的不稳定性会影响到工程菌在发酵、生产过程中的稳定性和可靠性，因此对于工程菌的传代稳定性进行深入研究具有重要的意义。

本文将对工程菌传代稳定性的影响因素及解决方案进行系统的论述。

二、工程菌传代稳定性影响因素1. 外源DNA插入点外源DNA在工程菌中的插入点会直接影响到工程菌的稳定性。

如果外源DNA插入到工程菌的基因组中的激活区域，可能会导致基因的过度表达或失活。

这种情况会对细胞的代谢特性产生明显影响，从而影响到工程菌的传代稳定性。

2. 外源DNA拷贝数外源DNA在工程菌中的拷贝数也是影响传代稳定性的一个重要因素。

外源DNA拷贝数过高可能会导致工程菌的基因组不稳定，进而影响到其传代稳定性。

而且外源DNA拷贝数过高还容易导致外源基因与细胞内自身基因发生重组，从而引起基因突变和适应性降低。

3. 环境条件环境条件对于工程菌的传代稳定性也有一定的影响。

例如，温度、pH值、营养条件等环境因素都可能影响到工程菌的代谢特性和遗传稳定性。

另外，在野外环境中，外源菌可能会受到生物环境因素的影响，加速了基因突变的发生。

三、工程菌传代稳定性解决方案1. 合理设计外源DNA插入点在进行工程菌的遗传改造时，应该注意选择适当的外源DNA插入点。

合理的外源DNA插入点可以降低外源DNA对细胞代谢特性的影响，减少基因的过度表达或失活等现象，从而提高工程菌的传代稳定性。

2. 精细调控外源DNA拷贝数在进行工程菌的遗传改造时，应该对外源DNA的拷贝数进行精细调控。

避免外源DNA拷贝数过高，减少基因突变和适应性降低的发生概率，从而提高工程菌的传代稳定性。

3. 优化环境条件在工程菌的发酵、生产过程中，应该优化环境条件，保持细胞的代谢稳定性。

保持适宜的温度、pH值和营养条件，可以减少外源菌受生物环境因素的影响，降低基因突变的发生概率。

关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。

关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。

基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。

质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。

分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。

结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

1 常见分裂不稳定的两个因素：1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2 这两种菌比数率差异的大小。

2 提高质粒稳定性的方法2.1 选择合适的宿主菌；2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3 加入选择性压力；2.4 采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。

由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。

在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。

调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。

有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。

通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。

2.5 控制工程菌的培养条件；2.6 采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。

基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。

这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。