基因工程菌质粒的稳定性

质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。

工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。

菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。

一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。

如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。

质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。

使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。

质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。

Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。

基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。

第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。

2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。

3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。

5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。

2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。

3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。

简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。

基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。

从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。

1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。

为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。

但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。

此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。

常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。

使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。

2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。

带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。

此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。

由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。

质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。

前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。

为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。

基因工程菌的培养
发酵过程：两种菌的混合物的发酵过程
一．工程菌大规模培养的两个关键
1.工程菌的稳定性
不稳定的原因：质粒的不稳定：质粒的丢失
重组质粒发生DNA片段脱落
表达产物的不稳定
工程菌不稳定的因素：培养基的组成（合成培养基有利于宿主细胞的生长，不利
于外源基因的表达）
培养温度（低温有利于重组质粒的稳定遗传）
菌体的比生长速率
控制基因的过量表达
二、溶氧量
溶氧量过低时，说明葡萄糖过量，此时应降低流加速率；当溶氧量过高时，说明葡萄糖即将耗尽，此时应加大流加速率。

当甲醇流速过快时，溶氧量上升：当甲醇流加速率过慢时，溶氧量降低。

三、毕赤酵母
为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。

甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶。

生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。

因此利用醇氧化酶基因作为启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白。

四、重组毕赤酵母具体方法（三段法）
第一阶段：在甘油或葡萄糖为碳源的合成培养基中进行工程菌的分批培养，以累积菌体细胞。

第二阶段：在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培养，以进一步提高菌体量。

第三阶段：即诱导阶段，开始较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。

（要控制甲醇的流加量，浓度高于5g/L时，将会严重抑制细胞的生长。

重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究摘要基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。

本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。

提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。

关键词：基因工程菌；质粒；稳定性-I-Study on the stability of plasmid of recombinanthuman IL-2 E.coli bacteriaAbstractEscherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation.Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability-II-目录摘要 (I)ABSTRACT ............................................................................................................................... I I 前言. (1)1 材料与方法 (3)1.1试验材料 (3)1.1.1 菌种质粒 (3)1.1.2 培养基 (3)1.1.3 常用药品 (3)1.1.4试验仪器 (3)1.2试验方法 (3)1.2.1 基因工程菌的转化 (3)1.2.2 制平板 (3)1.2.3 连续传代 (3)1.2.4 鉴定 (4)2 结果与分析 (6)2.1不同代菌的传代结果 (6)2.2上述不同代质粒的电泳图 (8)2.3不同代质粒的酶切图 (9)2.4诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳图 (10)3 讨论 (11)3.1分析本试验所出现的问题 (11)3.2质粒稳定性影响的若干因素 (12)3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制 (12)3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性 (12)3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 (12)3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响 (12)4 结论 (14)参考文献 (15)致谢 (17)-III-前言随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。

第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。

2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。

3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。

5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。

2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。

3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。

简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。

关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。

关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。

基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。

质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。

分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。

结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

1 常见分裂不稳定的两个因素：1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2 这两种菌比数率差异的大小。

2 提高质粒稳定性的方法2.1 选择合适的宿主菌；2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3 加入选择性压力；2.4 采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。

由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。

在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。

调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。

有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。

通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。

2.5 控制工程菌的培养条件；2.6 采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。

基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。

这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。