下载文档原格式
《生物技术制药》课程笔记第一章：绪论一、生物技术的发展史1.1 生物技术概述生物技术是指人们利用微生物、动植物体对物质、能量、信息进行操纵的技术。
它广泛应用于食品、农业、环境保护、能源、医药等领域。
1.2 生物技术的发展简史生物技术的发展可以分为三个阶段：（1）传统生物技术阶段：早在公元前22世纪，中国就开始了酿酒、制酱、制醋等传统生物技术应用。
此后，世界各国也逐渐发展了各自的发酵技术。
（2）现代生物技术阶段：20世纪初，科学家们开始研究酶和微生物，发现了遗传物质DNA和RNA，并逐步揭示了生物体的遗传密码。
这一阶段的代表性成果包括抗生素的发现、遗传工程的创立以及生物制品的生产。
（3）生物技术革命阶段：20世纪70年代末，基因工程技术的发展使生物技术进入了一个新的时代。
基因克隆、基因编辑、基因组学等技术的突破，为生物技术在医药、农业、能源等领域的应用开辟了广阔前景。
二、生物技术药物1.2.1 生物技术药物概述生物技术药物是指利用生物技术方法生产的药物，主要包括蛋白质药物、抗体、疫苗、寡核苷酸药物等。
1.2.2 生物技术药物的特性生物技术药物具有以下特点：（1）高特异性：生物技术药物针对性强，能够精确作用于疾病相关分子。
（2）低毒性：生物技术药物通常来源于自然界中的生物体，毒副作用较低。
（3）复杂性：生物技术药物的结构复杂，生产过程需要严格控制条件。
（4）生产成本高：生物技术药物的生产设备、工艺和原材料成本较高。
三、生物技术制药1.3.1 生物技术制药概述生物技术制药是指利用生物技术方法生产药物的过程。
它主要包括基因工程、细胞培养、蛋白质工程等技术。
1.3.2 生物技术制药特征生物技术制药具有以下特征：（1）生产过程高度自动化、精确化。
（2）药物作用机制明确，针对性强。
（3）生产周期较长，生产成本较高。
（4）药物质量和安全性要求严格。
1.3.3 生物技术在制药中的应用生物技术在制药领域的应用主要包括：（1）生产生物技术药物，如蛋白质药物、抗体、疫苗等。
基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。
比如规模小，控制更精确，产物易失活等。
工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。
经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。
这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。
2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。
3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。
4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。
![[1174]《生物药学》](https://img.taocdn.com/s1/m/2b1cf2063968011ca3009167.png)
西南大学网络与继续教育学院课程代码： 1174 学年学季：20192单项选择题1、基因工程菌的稳定性至少要维持在（）以上. 30. 25. 40. 202、改造鼠源性单克隆抗体的首要目的是（）.降低免疫源性.延长半衰期.降低相对分子量.增加组织通透性3、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源.葡萄糖.甘油.甘露醇.蔗糖4、以下可用于菌种纯化的方法有（）.诱变处理.富集培养.高温灭菌.平板划线5、第三代抗体是指：（）.利用基因工程技术制备的基因工程抗体.融合细胞产生的单克隆抗体.多发性骨髓瘤细胞产生的免疫球蛋白. B淋巴细胞合成和分泌的球蛋白6、获得目的基因最常用的方法是：.化学合成法.逆转录法. DNA探针技术. PCR 技术7、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细.人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定.人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用.大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活.大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化8、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：（）.表达产物为糖基化蛋白质.表达产物为天然产物.容易培养，产物提纯简单.表达产物存在的部位是在菌体内9、外源基因在动物细胞与大肠杆菌中表达产物的主要区别是（）.糖基化.疗效可靠.产量高.性质稳定10、筛选杂交瘤细胞（脾-瘤融合细胞）选用的培养基是：（）. BME. RMP1640. HT. HAT11、鼠源性单克隆抗体改造后得到小分子抗体，常用的是（）.单链抗体. Fab 片段抗体.单域抗体.最小识别单位12、目前分离的1000多种抗生素，约2/3产自（）.病毒.细菌.放线菌.真菌13、基因表达最常用的宿主菌是：（）.大肠杆菌.枯草芽孢杆菌.酵母.链霉菌14、第三代生物技术（）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围. F. 海洋生物技术.细胞工程技术.基因工程技术.蛋白质工程技术15、发酵生产中培养基的成分是( ).碳源硫源无机盐和水.碳源氮源和水.碳源氮源无机盐微量元素和水.碳源氮源碱土金属元素和水16、人类第一个基因工程药物是：（）.人胰岛素.乙型肝炎疫苗.重组链激酶.促红细胞生成素主观题17、细胞因子参考答案：由细胞分泌的能调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖、分化和凋亡的小分子多肽物质18、生物药物参考答案：利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学、生病的制品19、发酵工程制药参考答案：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的药品，或直接把微生物应20、胰岛素参考答案：是胰脏的内分泌组织。
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】
实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
1．实验目的
（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理
重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。
此外，还需要考虑通风速度和搅
拌速度的增加，对泡沫和发酵液粘稠度的影响。
另外，工程菌的生长和繁殖也会使温度和PH值发生变化，也要及时进行调整在我们实验中，严格控制补料流加的速度，在有效提高菌体产量的同时提高目的蛋白表达量。
如果使用全自动发酵罐系统，发酵参数由计算机程序控制，则会大大完善高密度发酵工艺，因为程序化控制会使发酵参数自动达到最佳状态，而且参数的改变比手动要温和、平稳，这些都对工程菌的生长繁殖极为有利。
以上几个方面是建立工程菌发酵工艺的关键，对基因工程中的大多数工程菌来说，只要综合考虑，严格控制，都会建立起成熟稳定的高密度发酵工艺。
3．器材及试剂
（1）仪器
发酵罐、冷冻高速离心机，可见光分光光度计，恒温培养箱。
（2）试剂
①菌种和质粒宿主菌为BL21，表达质粒pET24a SA-IL-2和pET24aSA-GM-CSF由本研究所构建和常规保存。
②LB培养基（pH7.0）
蛋白胨10g/L
酵母粉5g/L
NaCl 10g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
③2Y 培养基（pH7.0）
蛋白胨 16g/L
酵母提取物 10g/L
氯化钠 4g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
④半合成培养基（pH7.0）
(NH4) 2SO4 1.8g/L
NH4Cl 0. 3g/L
蛋白胨 4g/L
酵母粉 2.25g/L
甘油 10g/L
磷酸盐适量( KH2PO4∶K2HPO4∶Na2HPO4·12H2O=2∶4∶7)
微量元素 MgSO4·7H2O 0.3g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
⑤补料基质（pH7.0）
酵母粉5g/L
蛋白胨 10g/L
MgSO4·7H2O 0.6g/L
甘油 170g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
⑥Bradford蛋白浓度测定试剂盒
4．实验步骤
（1）发酵用菌种的筛选
取一管冷冻保存的甘油菌，用接种环接种于LB平板上，37℃培养过夜，随即挑选单克隆菌种于含有5mL LB培养液的试管中，30℃培养至A600nm为0.4～0.6时，IPTG诱导表达，离心收集菌体，进行SDS-PAGE以检测表达情况。
将表达量最高的克隆作为发酵用种子,分装冷冻保存，每批发酵取出一管,以保证菌种的稳定性。
（2）工程菌的培养
①种子的活化：取冷冻保存的工程菌株划板，37℃培养约16h，挑单克隆接种于含3ml LB 培养基的试管中，37℃、200r/min培养10h左右，然后按试管培养基量的2%转种1次，在相同条件下培养4h即成为活化种子。
②工程菌三角摇瓶培养：取活化的种子，以2%接种量接种于含200ml 2YT培养基的500ml 摇瓶中，37℃、250r/min旋摇培养，当OD600值为1～2时可以作为5L发酵罐的菌种。
③5L高密度发酵培养：发酵罐中的起始工作体积为2.5L，在罐中接入200ml三角摇瓶培养的种子(接种量为4%)。
装料前校正pH和溶氧电极，发酵温度37℃，起始转速250rpm。
发酵过程的几个关键参数为：
A.溶氧量及转速：空气流速设定为每分钟1个发酵体积，搅拌转速控制和溶解氧量参数相关联，每30s提高或降低10r/min，溶解氧量控制在35%左右，最大转速达800r/min时通入纯氧；
B.pH值：自动流加30%的氨水，使pH值保持在7.0左右；
C.补料的流加：根据实际经验，用甘油代替葡萄糖作为碳源。
补料的流加分两个阶段进行在5h的分批培养后，5～9h补加含5g甘油的补料；9～13h加入含100g甘油的补料。
以上数据由微机自动收集和记录。
整个发酵过程中,通过改变pH值、活化和诱导时间、溶解氧浓度和补料的流加，观察工程菌的生长和目的蛋白的表达。
（3）菌体浓度、目的蛋白表达量、菌体总蛋白的测定
①菌体浓度的分光光度测定波长为600nm；
②使用灰度扫描仪测定电泳条带中目的蛋白含量
③Bradford法测定菌体总蛋白
要点提示：
（1）发酵前应探索诱导外源基因高表达的最适条件，以使重组大肠杆菌既能高密度生长又能高效率表达外源目的蛋白。
要实现外源基因的高表达而又不过多地影响宿主菌的生存，就必须优化诱导时期、诱导培养时间、诱导剂浓度等参数。
（2）发酵的全过程中不加补料，则由于碳源和氮源的供给不足，而收菌量和表达量均很低；所以，应该根据基因重组菌的需求，将限制性底物(通常为碳源)不断流加到反应器中，可避免高浓度底物的抑制作用。
限制性底物的流加速率决定了细胞的比生长速率，从而影响重组菌的稳定性及外源基因的表达。
维持补料分批发酵中重组菌恒定的比生长速率，应采用指数流加的方式，也可采用阶梯式提高流加速率的方法。
（3）高密度发酵中为了减少补料的稀释作用，通常采用高浓度补料液。
这些浓液加入发酵液后，须立即混匀，否则细胞与局部的高浓度补料接触会造成代谢的失控。
