微生物 基因工程菌

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(4):708~712*基金项目： 国家自然科学基金 （No.20276064） 资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授， 博导， 主要从事食品微生物相关的研究。

E­mail:<gqhe@>. 收稿日期：2006­12­25 接受日期： 2007­03­16 ·研究论文· 基因工程菌 产 茁 ­葡聚糖酶条件优化及产酶特性 *李青青 1 , 陈启和 1 , 蒋孝燕 1, 张秀艳 2 , 李 婷 1 , 何国庆 1 ** (1.浙江大学食品科学与营养系， 杭州 310029； 2.华中农业大学食品安全与微生物学系， 武汉 430070)摘要： 用乳清粉作为主要培养基组成， 采用正交试验对大肠杆菌 （ ） 重组菌 的发酵条件进行了优化，并 对粗酶液的酶学性质进行了研究。

重组菌 的最佳发酵条件为： 摇床转速 170r/min ， 接种量 1%， 发酵培养基初始 pH 6.0，种龄12h 。

重组菌茁 ­葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关， 发酵 14h 后， 菌体生物量最高可达1.71g/L ， 茁 ­ 葡聚糖酶活力最高可达 321.56U/mL 。

所得粗酶液的最适反应温度 60 ℃,pH 6.0， 在 70 ℃以下保温20min 后， 残余酶活力均在 80%以上。

在pH 5.0～9.0放置48h 后仍能保持均90%以上的残余酶活力。

关键词： 茁 ­葡聚糖酶；重组菌 EGs2； 发酵条件； 酶学性质 中图分类号: S182 文献标识码:A 文章编号:1006­1304(2007)04­0708­05Optimization of Recombinant Fermentation ConditionAffecting 茁­glucanase Production and Its Characteristics of Enzyme LI Qing­qing 1 ,CHEN Qi­he 1 ,JIANG Xiao­yan 1 ,ZHANG Xiu­yan 2 ,LI Ting 1 ,HE Guo­qing 1**The fermentation conditions of mutant obtained from directed evolution for thermostable 茁­glucanase for 茁­glucanase production were investigated by orthogonal experiment.Fermentation was conducted in 250mL flask,each containing 30mL of medium contained whey 10g/L,yeast extract 5g/L,NaCl 10g/L,the temperature was 37 ℃.The optima culture conditions were as following:initial pH 6.0,shaking speed 170r/min,inoculation volume 1%and inoculation time 12h. 茁 ­glucanase production by mutantwas associated with cell growth and biomass. 茁­glucanase activity was increased significantly when cells entered growth phase.The bacterium began the stable phase after cultured for 14h with the highest biomass 1.71g/L and 茁­glucanase activity 321.56U/mL.When 茁 ­glucanase was used as a substrate,the optimum temperature and pH were 60 ℃ and 6.0,respectively. After 20min incubation at 40,50,55,60,65and 70 ℃ respectively,the residual activity remained at least 80%.After 48h conserva­ tion at pH 5.0~9.0,the residual activity remained at least 90%.The enzyme was stable below 70 ℃ and at pH 5.0~9.0.茁­glucanase;mutant ;fermentation condition;enzyme characteristic茁­1,3­1,4­ 葡聚糖酶是重要的工业用酶。

工程菌的知识基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。

研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。

这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。

关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。

要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。

这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。

而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。

对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。

E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。

医学微生物学总结一、绪论微生物：是一类体积微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须用光学显微镜或者电子显微镜放大才能观察到的微小生物的总称。

分类：（按照微生物的结构特点、遗传特性及分化组成）原核细胞型微生物：细菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、放线菌真核细胞型微生物：真菌、藻类、原生动物非细胞型微生物：病毒（结构最简单的微生物）最常用的基因工程菌：酵母菌、大肠埃希菌德国医生郭霍创立了：细菌染色方法、固体培养试验、动物感染实验第一个被发现的病毒是：烟草花叶病毒现代微生物学常用的诊断方法：免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、酶联聚合反应（PCR）、核酸杂交技术。

朊粒：比病毒更简单的没有基因结构的致病因子。

二、细菌（一）细菌的基本结构细菌的基本结构：细胞壁（由肽聚糖组成呈L型细菌）、细胞膜（中介体）、细胞质（核质、质粒、异染颗粒）细菌的特殊结构：荚膜（功能：抗吞噬，与致病性有关；抗干燥，渗透屏障；黏附作用）、鞭毛（有助于细菌运动，有的与其致病性有关）、菌毛（黏附作用，与治病性有关；还可以经接合转移遗传物质）、芽孢（有强抵抗力，是灭菌指标；用于鉴别特殊细菌；可是某些外源性感染的传染源）细菌的生长繁殖方式：二分裂方式进行无性繁殖。

生长曲线：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。

（意义：用于细菌鉴定、研究工作和生产实践）中介体：是细菌细胞膜的特有结构，是部分细胞膜内陷、折叠、卷曲而成的囊状物，多见于革兰氏阳性菌。

位于菌体的侧面或中间部，可有一个或者多个。

细菌的形态和大小：（测量单位：um）细菌的形态特征代表菌球菌双球菌在一个平面上分裂，分裂后有两个菌体成对排列脑膜炎奈瑟菌链球菌球菌在一个平面上分裂，分裂后多个菌体无规则地粘连成链状乙型溶血性链球菌葡萄球菌在多个不规则的平面上分裂，分裂后无规则的粘连在一起金黄色葡萄球菌杆菌直杆菌大、中、小炭疽芽孢杆菌、大肠埃希菌、布鲁菌分枝杆菌呈分枝状生长结核杆菌棒状杆菌菌体末端膨大呈棒状百喉杆菌梭杆菌菌体两端尖细呈梭状坏死梭杆菌螺形菌弧菌菌体只有一个弯曲，呈逗点状或弧状霍乱弧菌螺菌菌体有数个弯曲鼠咬热螺菌螺杆菌菌体细长呈弯曲型s型或海鸥型幽门螺旋杆菌（二）、细菌的鉴别及基本培养基常用于肠道杆菌的鉴别的生化反应合成为IMViC：I指吲哚实验、M指甲基红实验、Vi指VP实验、C指据元酸钠试验。

基因工程菌发酵、表达与纯化
一、原理
基因工程菌是利用基因重组技术构建的生物工程菌，带外源基因的重组载体，通过生物工程菌的发酵获得大量的外源基因产物,并尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，所以需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵、表达和纯化工艺。

二、仪器
发酵罐、SDS-PAGE电泳仪
三、试剂
LB培养基（包括Yeast Extract、Polypeptone等）、琼脂、甘油
四、实验步骤
1. 在LB 培养基中加入细菌培养用琼脂(15 g/L ) 铺平皿, 用接种环划线接种甘油管基因工程菌菌种, 30℃培养过夜；
2. 挑取单菌落接种于含5 m l LB (含50ug/mL Amp ) 的试管中, 30℃、120 rpm摇菌培养到OD600 为0.2-0.8；
3. 取1 mL于另一试管中42℃培养3 小时, 离心收集菌体；
4. 以10%的接种量上发酵罐发酵培养；
5. 接种LB培养液诱导表达，采用SDS-PAGE电泳分析其表达量；
6. 据基因工程菌表达产物的不同采用不同的分离纯化方法，如盐析、层析、萃取等。

五、注意事项
在基因工程菌的发酵过程中，培养基的种类、pH值、培养的温度及接种量和发酵时间都会对其发酵效果及表达产物的分离纯化产生不同的影响，所以应多次试验进行全方面的优化。

生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数：482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。

（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。

2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。

重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。

发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。

工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。

目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。

另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。

当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。

补料的流加方式直接影响着发酵的效果。

分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。

但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。

过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。

基因工程菌名词解释
基因工程菌：
基因工程菌是指通过改变物种的基因组配置，来改变它们的性状和行为的细菌。

基因工程菌通常可以被用来生产蛋白质，诊断和治疗疾病，催化化学反应，检测物质以及进行环境修复等。

合成生物学：
合成生物学是一门研究将生物技术应用于生物设计，建构和控制的跨学科领域。

它将传统的生物学与过程控制，信息和通信技术，计算机科学和系统工程等综合科学结合起来，共同实现和设计新的生物系统。

它开发和优化复合生物系统，以达到创造性，可控制而有效的测量和监测应用。

转基因：
转基因是基因工程技术中的一种，是指将一个物种的基因片段引入到另一个物种体内，以赋予其特定性状的过程。

转基因技术可以让人们获得更多的营养，同时也有可能会带来环境问题(例如，会影响另一个物种的生态平衡)。

这是因为转基因会改变物种的基因组配置，从而导致这些基因的表现。

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一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是一种被广泛应用于生物技术领域的微生物。

它们通过基因工程技术的手段，对其自身的基因进行改造和调控，以实现特定的生物合成功能。

本文将介绍基因工程菌的制备方法和应用，并展示其在生物技术流程中的重要作用。

一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括基因克隆、质粒构建、转化和筛选等步骤。

1. 基因克隆：首先，从目标物种中提取所需基因的DNA序列。

然后，利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目标基因。

接下来，将扩增得到的基因片段与载体DNA进行连接，形成重组质粒。

2. 质粒构建：将重组质粒导入到宿主菌中，通过细菌培养和质粒提取等步骤，得到含有目标基因的质粒。

3. 转化：将质粒导入到目标菌株中，使其拥有目标基因。

转化方法有多种，如电穿孔法、化学法和冷冻复苏法等。

4. 筛选：利用适当的筛选标记，如抗生素抗性基因，筛选出带有目标基因的转化菌株。

同时，可以利用聚合酶链式反应(PCR)技术对转化菌株进行检测和确认。

二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物技术领域有着广泛的应用，涉及到药物生产、生物燃料生产、环境修复等多个领域。

1. 药物生产：基因工程菌可以被用于合成药物原料。

通过引入相应的基因，使宿主菌株具备合成目标化合物的能力。

例如，利用基因工程菌可以合成抗生素、抗癌药物等。

2. 生物燃料生产：基因工程菌可以通过代谢途径的改造，使其能够高效地合成生物燃料。

例如，利用基因工程菌可以将废弃物转化为乙醇、丁醇等可燃烧的化合物。

3. 环境修复：基因工程菌可以被用于环境修复，以清除有毒或有害物质。

通过引入特定的基因，使基因工程菌具备降解有害物质的能力。

例如，利用基因工程菌可以降解石油污染物、农药等。

基因工程菌的应用流程一般包括以下几个步骤：1. 基因选择：根据目标产物的要求，选择合适的基因进行克隆。

2. 基因克隆：将目标基因克隆到适当的载体上，构建重组质粒。

3. 转化：将重组质粒导入到宿主菌中，使其拥有目标基因。

酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用随着科技的发展，食品生物技术在食品工业发展中的地位和作用越来越大，已经渗透到食品工业的方方面面，特别是基因工程技术等技术在21世纪的食品工业中充当重要的角色。

而工程菌就是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系，是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。

主要应用于治理海洋石油泄漏，生产基因工程药物，酵母基因工程中等方面。

而酵母基因工程中，酵母基因工程菌就是菌类细胞株系用的是酵母菌，能够发挥着一定的功能，可以提高发酵的效率。

酵母基因工程的优点：1.是真核生物，大多具有价高的安全性。

2.繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力。

3.将原核生物中已知的分子和基因操作技术与真核生物中复杂的转运后修饰能力相结合，能方便外缘基因的操作。

4.采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导调控。

5.提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物和天然蛋白质一样或类似。

6.酵母菌可表达外源蛋白与末端前导肽融合，指导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰。

7.不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯8.移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物中使用中引起免疫反应的问题。

9.酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序，他具有比大肠杆菌更完备的基因表达控制机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力。

10.酵母可进行蛋白的N-乙酰化，C-甲基化，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要意义。

构建基因工程菌是一个复杂、繁琐的过程，因此构建酵母基因要注意：1、结构简单，易于研究2、繁殖能力强，数目多3、成本低，易于培养、4易于观察。

一．酵母基因工程菌的构建过程：1.目的基因的获取：获取目的基因是实施基因工程的第一步，有三种方法提取目的基因。

（1）从自然界中已有的物种中分离出来：.从基因文库中获取目的基因（俗称：鸟枪法）：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。

一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是指经过基因工程技术改造的微生物菌株，广泛应用于生物工程、医学和农业等领域。

本文将介绍一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程。

一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括以下几个步骤：1. 选择宿主菌株：根据所需的功能和目标，选择合适的菌株作为宿主，常见的宿主菌株有大肠杆菌、酵母菌等。

2. 提取目标基因：从源菌株中提取所需的目标基因，可以通过PCR 扩增、限制性内切酶切割等方法获取目标基因片段。

3. 载体构建：将目标基因片段与合适的载体进行连接，构建重组载体。

常用的载体有质粒、噬菌体等。

4. 转化：将重组载体导入宿主菌株中，使目标基因能够稳定表达。

5. 筛选和鉴定：经过转化的菌株进行筛选和鉴定，常用的方法有抗性筛选和PCR鉴定等。

6. 培养和扩大：经过筛选和鉴定的基因工程菌株进行培养和扩大，得到足够的菌体。

二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物工程、医学和农业等领域有广泛的应用。

下面以生物工程领域为例，介绍基因工程菌的应用与流程。

1. 目标基因的克隆与表达从源菌株中提取目标基因，并通过PCR扩增获取目标基因片段。

然后将目标基因片段与适当的载体连接，构建重组载体。

接下来，将重组载体导入宿主菌株中，经过筛选和鉴定，获得含有目标基因的基因工程菌株。

最后，通过培养和表达优化等步骤，使目标基因在基因工程菌中稳定表达，并获得足够的目标蛋白产物。

2. 代谢工程与合成生物学基因工程菌在代谢工程和合成生物学中起到重要作用。

通过基因工程技术，可以改造菌株的代谢途径，使其具有特定的代谢功能。

例如，通过引入外源基因，可以使菌株具备合成特定化合物的能力，如生物染料、药物等。

通过调控代谢途径中的关键基因表达水平，还可以实现代谢产物的高效合成。

3. 蛋白质工程与酶工程基因工程菌在蛋白质工程和酶工程中也有广泛应用。

通过基因工程技术，可以改变蛋白质的结构和功能，实现蛋白质的改良和优化。