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一株对羟基苯甲酸甲酯降解菌的生长及降解特性研究
对羟基苯甲酸甲酯（MMP）是一种广泛使用的有机污染物。
许多微生物能够通过菌株之间的互补作用来利用MMP，然而，在MMP为唯一碳源的条件下，如何选择快速生长并具有相应降解能力的菌株是十分重要的。
本文旨在通过研究一株对MMP具有高生长和降解能力的细菌来深入了解MMP降解生物学特性。
实验采集了从市区河流中采集的不同细菌菌株样品。
通过在含有MMP的胆汁琼脂和液体培养基中比较不同细菌的生长速度和MMP去除效率。
结果表明，菌株B1能够在15小时内以优异的速度生长，并降解掉90％的MMP。
转化产物经过质谱分析后表明，MMP在B1细胞中的降解途径是法洛三环氧化酶的介导下，先将MMP转化为对羟基苯乙酸甲酯（MHPM），然后转化为苯酚并且最终被降解为原始物质。
通过对B1的基因组进行测序和比对，发现B1为一株属于铜绿假单胞菌属（Pseudomonas aeruginosa）的细菌，特征为具有高效合成酶和氧化酶。
实验进一步探究了不同pH和温度对B1的生长和MMP降解效率的影响。
在较低的温度下（4℃和15℃），B1的生长显著减缓，但在较高温度下（30℃和37℃），B1的生长和MMP降解能力均得到了显著提高。
在不同pH值下，B1是在pH 7.5的条件下表现出最优的生长速度和MMP降解效率。
综上所述，本研究成功地分离的B1是一株对MMP具有较强降解能力的细菌，能够在相对宽广的温度和pH范围内高效生长及降解MMP。
这些结果对于未来合理选择最合适的细菌降解MMP有重大的指导意义。
农药降解微生物的筛选和鉴定随着农业生产的不断发展和进步，农药的使用逐渐成为了提高农作物产量和品质的重要手段。
然而，长期高强度使用农药也给生态环境和人类健康带来了一定的风险和威胁。
为了减少农药对环境和人体的危害，寻找一种安全、高效的降解方法已经成为了重要的研究方向之一。
而利用微生物进行农药降解成为了一种备受关注的解决途径，因为微生物可以通过吸附、降解、转化等方式将农药降解无害物质，从而实现环境和人健康的保护。
然而，微生物降解效率的高低，直接决定了它在农药降解过程中的应用价值。
因此，寻找适合的微生物进行农药降解，成为了重要的研究点之一。
第一步要做的事情是筛选。
为了寻找适合降解农药的微生物，首先需要从自然界中的土壤、水体等样本中开展微生物的筛选研究。
一般而言，选择样本时要尽量选取与目标农药污染草地有较强的关联性和相似地理位置的样本，以期能够找到更适合的菌种。
在筛选的过程中，应该注意到不同菌种在降解效率、降解速度、生长适应条件、细胞生命等方面存在较大差异。
因此，需要针对目标农药，制定更加具体的微生物鉴定方案，设计合理的实验方案促进筛选工作的开展。
接下来，就要进行种菌和鉴定。
在筛选出适合降解农药的微生物后，需要进行种菌工作，并发展良好的微生物种质资源。
在细菌鉴定过程中，可以通过以形态、生理生化、分子生物学等方法进行鉴定，以期更加准确地判定细菌种类和特征，进一步验证其对农药的降解能力和效率。
比如，针对目标农药的种类与形式不同，可能导致微生物对其降解效率与速度差异较大，因此在进行初步筛选工作的同时，就要进行微生物的鉴定和潜力评价。
最后，就需要量化评价。
针对筛选的适合降解农药的微生物进行量化评价与实验验证，是推动微生物农药降解向工业化、标准化方向的主要应用手段。
在量化评价的过程中，主要包括解析菌株对农药的降解效率、降解速度、降解产物和适应环境等方面的具体表现。
同时，建立科学合理的微生物降解评价标准，对于促进微生物降解的推广应用也有着重要的意义。
石油污染土中微生物的分离鉴定及降解特性石油污染是环境污染中的一种常见问题，对自然环境和人类健康造成严重影响。
因此，寻找高效的石油降解菌是解决这一问题的重要途径。
本文从石油污染土壤中分离鉴定了一株降解菌，并探究了其降解特性。
（1）样品的采集及处理从受污染的土壤中取样，再分离出单个菌株。
将样品加入到NaCl0.9%的生理盐水中，摇动15分钟后，离心上清，然后采用1%的蒸馏水进行0.5小时热灭菌。
（2）分离鉴定将上述处理后的样品，分别接种于处理好的LB及玉米精蛋白培养基中，置于30℃恒温振荡培养箱中培养48h。
在此基础上，通过对菌落形态、菌株生长速度、菌落气味、荧光反应、产酶等特征，对细菌进行鉴定。
最终，筛选出一株石油降解菌。
（3）降解特性分析选取某种石油类物质，将其加入到LB培养基中，最终浓度设置在30mg/L左右。
将选出的石油降解菌接种进去，接种数量为OD600=0.1。
进液管任意长度分别设置于接种前及接种后，能够记录pH值及菌量。
取样分析的样品保持30℃培养48小时，过程中定时测量液体的pH值。
分析降解特性时，发现石油降解菌能够将石油类物质中的碳链分解，并分解成细胞利用的有机物质。
在石油降解过程中，菌落数逐渐增加；液态培养基中pH值不断降低，并最终将其稳定在中性状态。
另外，菌落色素通过两次衍生化反应生成焦磷酸一茎丙酮醇酯，之后通过JB-4消失化学反应结晶，能够得到石油降解特性的分析结果。
综上所述，石油降解菌是一种能够有效降解石油类物质的微生物。
因此，在现实中，可以对这类石油降解菌进行大规模培养及应用，以降低环境中的石油污染。
江苏农业学报(J iangsu J.of Agr .Sci .),2010,26(2):443～445李红梅,魏艳丽,任 艳,等.一株毒死蜱降解菌的分离鉴定及降解特性[J ].江苏农业学报,2010,26(2):4432445.一株毒死蜱降解菌的分离鉴定及降解特性李红梅, 魏艳丽, 任 艳, 张新建, 王贻莲, 李纪顺, 杨合同(山东省科学院中日友好生物技术研究中心,山东省应用微生物重点实验室,山东济南250014)收稿日期:2009206204基金项目:中白政府间合作项目(S2010GR0324);国际合作"走出去"项目(2009DF A32340);山东省科学院博士基金项目(200607)作者简介:李红梅(19772),女,山东省禹城人,硕士,助理研究员,主要从事农业微生物方面的研究。
(E 2mail )hm lihm @通讯作者:杨合同,(E 2mail )yanght@keylab .net 关键词: 毒死蜱;降解菌;降解特性中图分类号: S567.3 文献标识码: A 文章编号: 100024440(2010)022*******Isol ati on,I denti fi cati on and Degradi n g Characteristi cs of Chlorpyri fosDe 2gradi n g Bacter i u mL I Hong 2mei, W E I Yan 2li, REN Yan, ZHANG Xin 2jian, WANG Yi 2lian, L I J i 2shun, Y ANG He 2t ong(B iotechnology Center of Shandong Acade m y of Sciences,Key Laboratory of A pplied M icrobiology of Shandong P rovince,J inan 250014,China ) Key words: chl or pyrifos;degrading bacteriu m;degrading characteristic 毒死蜱(Chl or pyrif os ),是目前全球应用最广泛的有机磷类杀虫剂之一,具有极低的水溶性和很高的土壤吸附型。
毒死蜱在农业上的广泛应用造成了严重的残留问题,其在土壤中的残留期较长,半衰期从十几天到几百天不等[1],不但对土壤环境造成污染,而且对水生生物及蜜蜂有毒害,这些成为人们亟待解决的问题。
微生物降解是农药在土壤环境中降解的主要途径,目前国内外对毒死蜱降解菌分离的报道,主要有细菌[228]和真菌[9213],其中以细菌为主。
分离筛选高效降解微生物是人们进行毒死蜱污染治理、土壤修复的有效措施。
本研究旨在寻找有价值的降解菌,并优化其生长和降解条件,为农药的生物治理提供技术支持。
1 材料和方法1.1 材料菌种分离于山东华阳农药化工集团排污口的污泥;毒死蜱原药纯度为96%;无机盐(MM )培养基配方参照文献[3]。
1.2 降解菌株的富集、分离、纯化方法参照文献[6]。
1.3 菌株筛选1.3.1 活化、接种 挑取单菌落活化后,菌体洗涤,制备成OD 600=110的菌悬液,按10%接种到含100mg/L 毒死蜱的无机盐培养基中,30℃、200r/m in 振荡培养,72h 后测定菌体的生长量和降解率,同时设不接菌作为空白对照。
1.3.2 毒死蜱残留量的测定 溶液中残留毒死蜱的萃取和测定参照谢慧等[14]的方法进行。
降解率=[(样品中毒死蜱含量-对照中毒死蜱含量)/毒死蜱起始加入量]×100%。
1.4 菌株降解特性试验初始毒死蜱浓度设置为:10mg/L 、50mg/L 、100mg/L 、200mg/L 、300mg/L,pH 值设置为:5、6、7、8、9,72h 后测定毒死蜱的降解率。
1.5 鉴定菌株形态及生理生化指标鉴定参照文献[15]的方法,16Sr DNA 克隆和序列比较参照文献[16]的方法。
1.6 N 16菌株降解毒死蜱中间产物的检测采用高效液相色谱(HP LC )检测,方法及条件参照文献[3]进行。
2 结果2.1 菌株筛选分离到有降解能力的菌株3株,编号分别为N16、N37、N432,72h 内降解率依次为65%、50%、58%,选降解率最高344的N16进行下一步研究。
2.2 菌株的鉴定菌体成小球形,常两个或多个连在一起,G–,不产芽孢,接触酶阳性;M.R.阴性,V.P.阳性,好氧,不能水解淀粉,不能液化明胶,能水解卵磷脂。
菌落光滑圆形、透明,最适生长温度为37℃,最适pH为710。
16S r DNA序列同源性比较显示,其与不动杆菌同源性达97%,结合生理生化特征,将该菌初步鉴定为不动杆菌属(A cinetobacter s p.)。
2.3 底物浓度对菌株降解率的影响30℃时N16最适生长和降解底物浓度为100mg/L。
农药浓度低时碳源不足,影响菌体的生长,其降解性能得不到充分发挥;浓度高时,虽然降解率降低,但绝对去除量增大。
2.4 pH值对菌株生长和降解率的影响30℃时N16最适生长的pH值为710,在偏碱性条件下生长良好,降解率高;偏酸性时生长受到抑制,降解率低。
2.5 菌株对毒死蜱降解中间产物的检测结果显示,在230n m扫描下,中间产物3,5,62三氯222吡啶酚(T CP)的保留时间为3197m in,毒死蜱的保留时间为11183m in,含100mg/L毒死蜱的培养基接种菌种N16后,毒死蜱的量显著减少,主要生成TCP。
3 讨论不动杆菌属是一类降解能力很强的细菌,可降解多种环境污染物,如石油、苯酚、菲、小分子有机磷、甲胺磷及微囊藻毒素等[17221]。
本研究从农药厂排污沟的污泥中分离到1株能降解毒死蜱的菌株N16,初步鉴定为不动杆菌属,革兰氏染色为阴性,这对以后的基因操作和发酵生产等都是有利的。
已报道的毒死蜱降解菌株中,降解率最高的为鞘氨醇单胞菌(Sphingo m onas s p.)[3],该菌24h内对100mg/L毒死蜱的降解率达100%;其次为节杆菌属(A rthrobacter s p.),24h 内对100mg/L毒死蜱的降解率达8618%[8];其他报道的菌株降解率相对都较低。
我们分离得到的N16菌株对100 mg/L毒死蜱的降解率72h内可达65%,具有潜在的应用价值。
菌株N16对毒死蜱的降解特性与毒死蜱浓度、pH值等有关。
100mg/L的毒死蜱最适于菌株的生长,降解率最高,浓度过高时中间代谢产物(3,5,62三氯222吡啶酚,TCP)积累,而T CP对菌体本身有明显的毒害作用[22],反馈抑制了对毒死蜱的降解,在实际应用中应综合考虑农药的降解率和绝对去除量,使投放的菌剂量达到最佳。
在pH710时菌株生长最好;pH910时对毒死蜱的降解效果最好,因为碱性条件下毒死蜱易于水解[23]。
菌株N16对毒死蜱的降解与已经报道的毒死蜱生物降解机理相同,都是降解为TCP,且TCP都有积累,如Enter2 obacter s p.B214、S tenotropho m onas s p.YC21和Sphingo m onas s p.D s p22。
相比毒死蜱,TCP的毒性降低很多,而且可在自然条件下被其他微生物类群或物理、化学因子彻底降解。
能彻底矿化毒死蜱的细菌很少有报道,Feng等以TCP为唯一碳源筛选到1株Pseudo m onas s p.,该菌株3周内可将100mg/L 的TCP完全矿化[22]。
因此,筛选可完全矿化TCP的菌株也很重要,以期在消除毒死蜱污染的实践中,混合培养毒死蜱降解菌和TCP降解菌,达到彻底降解毒死蜱的目的。
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