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Bacillus cereus HY-4对有机磷农药毒死蜱的降解特性余利;段海明【摘要】目的:明确一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus HY-4)对毒死蜱的降解特性.方法:采用UV全波长扫描、灵敏度和添加回收率测定等建立了毒死蜱的定量检测方法,以及通过定量添加毒死蜱和降解菌的方法研究了菌株HY-4对毒死蜱的降解特性.结果:毒死蜱的最佳测定波长为292.0 nm,经验证该检测方法的线性相关性、灵敏度、准确度和变异系数均符合菌株降解毒死蜱残留检测的要求.降解菌HY-4对50.0 mg/L毒死蜱的降解率在摇培36 h时达到最高,适量添加葡萄糖能够促进降解菌的生长和毒死蜱的降解,葡萄糖添加量为0.5％时对50.0 mg/L毒死蜱的降解率达最高为88.0％;毒死蜱初始浓度对降解率也有较大影响,毒死蜱初始浓度为50.0 mg/L时降解率达最高为89.6％,然而当毒死蜱初始浓度继续升高时,菌株对毒死蜱的降解率下降,毒死蜱初始浓度为200.0 mg/L时,降解率下降至59.3％.结论:降解菌HY-4对毒死蜱的降解能力较强,在毒死蜱污染水体等的微生物降解方面应用价值较大.【期刊名称】《安徽科技学院学报》【年(卷),期】2017(031)005【总页数】7页(P81-87)【关键词】蜡状芽孢杆菌;有机磷农药;毒死蜱;检测方法;降解特性【作者】余利;段海明【作者单位】安徽科技学院农学院,安徽凤阳 233100;安徽科技学院农学院,安徽凤阳 233100【正文语种】中文【中图分类】X592毒死蜱(Chlorpyrifos)为有机磷农药中的骨干品种，广泛用于粮棉、果树和蔬菜等作物防治多种害虫。
随着用量加大，其在环境中的残留势必会逐渐增多[1]。
然而，毒死蜱作为一种异源有毒物质，加上其较高的土壤吸附性和水体中较长的半衰期，毒死蜱已在多个生态系统中被检测到，毒死蜱对生态环境的潜在危险性不容忽视[2]。
生物降解法是被人们认为从环境中消除有机磷农药污染最为可行的方法[3]。
毒死蜱当前仍是全球应用最广泛的五种杀虫剂之一，也是我国用量最大的农药品种，是对硫磷、甲胺磷等高毒有机磷农药的替代品种，主要作为农用杀虫剂防治水稻、蔬菜等作物的螟虫、韭蛆等近百种害虫，也作为卫生杀虫剂用于防治白蚁和蟑螂等[5]。
美国在20世纪末期毒死蜱年用量就已达到约7000吨，其中3/4以上被应用于植物保护，其余则用于家庭卫生。
毒死蜱系列产品（乐斯本乳油）于1984年在我国农业部农药检定所取得登记，获准在水稻、棉花、蔬菜等作物上使用；同年，上海市政府在菜篮子工程建设中，推荐了乐斯本等几种农药用于防治蔬菜害虫，以彻底取代甲胺磷等高毒农药。
虽然毒死蜱属于中等毒性杀虫剂，但危险性仍然很大，它能够通过皮肤进入人体，并且在人体内有累积现象，长期或重复给予亚毒性剂量即可对细胞、神经轴突等产生影响，甚至可引起行为改变,WHO规定的毒死蜱可接受摄取量为10μg/kg/d[6,7]。
随着健康及环保标准的提升，在许多发达国家毒死蜱已被禁止使用，2000年6月8日美国环保署（EPA）宣布，禁止在美国家庭和庭院内使用毒死蜱杀虫剂，指出这种常用的杀虫剂会危害到儿童的健康安全。
依据美国环保署的意见，新西兰政府决定含有毒死蜱的产品自2005年12月31日将不再应用于白蚁的防控，并号召取消毒死蜱在所有有可能导致孩子暴露的地方使用，2011年10月28日，新西兰环保署提议禁止毒死蜱用于花园。
为了保证儿童健康，几乎所有的发达国家都已经禁止毒死蜱应用于家居，但是并没有完全禁止其在农业领域使用；在大多数发展中国家，毒死蜱仍是应用最广泛的农用杀虫剂、由于经济、技术发展的限制，短期内也不可能完全禁止毒死蜱的应用，那么如何减少应用毒死蜱所导致的负面影响就成为一个亟待解决的课题。
1.2 毒死蜱的微生物降解研究进展微生物的降解作用被认为是环境中有机磷农药残留降解的最主要因素，因此分离筛选能够高效降解有机磷农药的微生物是解决农药污染，进行环境修复的一项有效措施[8,9]。
毒死蜱降解菌的筛选及降解特性李繤;尚建超;蓝潇;田学军;沈登荣【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2016(044)009【摘要】为寻找有机磷农药的快速降解途径，采集污染严重的土样，以毒死蜱为底物，采用梯度驯化法筛选得到菌株CJC－3，并研究该菌株对毒死蜱及其他4种常用有机磷农药（敌敌畏、辛硫磷、乙酰甲胺磷、草甘膦）的降解特性。
结果表明，CJC －3对毒死蜱的最佳降解条件：温度为28℃，培养时间为48 h，农药浓度为2000 mg／L，降解率达76.03％。
优化CJC－3对其他有机磷农药的降解条件后，降解率分别为敌敌畏50．47％、辛硫磷65．29％、乙酰甲胺磷26．15％、草甘膦36．12％，表明该菌株对有机磷杀虫剂和有机磷除草剂均有一定的降解效果，适用于有机磷农药的普遍降解。
【总页数】3页(P479-481)【作者】李繤;尚建超;蓝潇;田学军;沈登荣【作者单位】红河学院生命科学与技术学院/云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自661199;红河学院生命科学与技术学院/云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自661199;红河学院生命科学与技术学院/云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自661199;红河学院生命科学与技术学院/云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自661199;红河学院生命科学与技术学院/云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自661199【正文语种】中文【中图分类】X592【相关文献】1.毒死蜱降解菌的筛选·鉴定·降解特性 [J], 罗鑫;张海燕;邵彪;刘明元2.毒死蜱降解菌的筛选及其特性的研究 [J], 刘知远;牛明芬;李卓坪;张迪;庞小平;李汉楠;崔伟3.毒死蜱降解菌的筛选及其降解特性的研究 [J], 王其进;陶玉贵;谷浩4.毒死蜱降解菌降解特性及其降解条件优化 [J], 杜晓敏;王金花;朱鲁生;王军;杨莉莉;林琳5.毒死蜱降解菌的驯化筛选及高活性毒死蜱降解菌群的构建 [J], 孙孝文;刘诚;王慧敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
[收稿日期] 2010201227;2010203217修回 [基金项目] 贵州省教育厅培育项目“动物及微生物有机磷降解酶基因的分离、鉴定及基因工程研究”[黔教科(2007)001];贵州省自然科学基金项目“猪对氧磷脂酶调节脂肪代谢的分子机制”[黔科合J 字(2008)2129] [作者简介] 金 鑫(1983-),女,在读硕士,研究方向:微生物学。
3通讯作者。
E 2mail :jfwang @[文章编号]100123601(2010)042022920103204农田土壤中毒死蜱降解菌的分离与鉴定金鑫1,冉雪琴1,王嘉福1,23(1.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;2.贵州大学农业工程省重点实验室,贵州贵阳550025) [摘 要]为分离出能降解有机磷农药的有效菌株,从长期施用有机磷农药的土壤中筛选出101株菌株,利用紫外分光光度计在293nm 处测定了分离菌株的降解效率,结合形态学和16S rDNA 序列初步分析了随机挑选的10株分离菌株的遗传多样性。
结果表明,长期施用农药的土壤中存在大量能够降解毒死蜱农药的微生物,其中以杆状菌居多,共获得68株杆菌。
经初步鉴定,10株菌株分别为葡萄球菌属(S ta p hy lo 2coccus )、假单胞菌属(Pseu domonas )、肠杆菌属(Enterobacter )、芽孢杆菌属(B acill us )、气单胞菌属(A ero 2monas )和黄杆菌属(Fl avobacteri um )6个属。
首次分离出气单胞菌属的毒死蜱降解菌。
[关键词]毒死蜱;分离;降解;细菌;贵州[中图分类号]S482.3+9[文献标识码]AIsolation and Identification of s Degradation Bacteria in SoilJ IN Xin 1,RAN Xue 2qin 1,WAN G Jia 2f u 1,23(1.School of Animal Sciences ,Guizhou Universit y ,Guiya ng ,Guizhou 550025;2.Guizhou Key L aborator y f orAgricultural Engineering ,Guizhou Universit y ,Guiyang ,Guizhou 550025,China ) Abstract :101strains were selected from the soil polluted by organophosphorus pesticides for many years to isolate effective strains to degrade organophosphorus pesticides.The degradation efficiency of the selected strains was determined by the ultra 2violet spectrophotometer.The genetic diversity of 10randomly selected strains was analyzed by determining 16S rDNA sequence and morphological characteristics.The results showed that there was a lot of microorganism to degrade chlorpyrifos in the soil applied by pesticides ,and 68bacilliform bacteria strains were isolated.10randomly selected strains belong to S taphylococcus ,Pseudomonas ,Enterobacter,B acillus ,Aeromonas and Flavobacterium respectively.The chlorpyrifos degradation strain of A eromonas is first isolated.K ey w ords :chlorpyrifo s ;isolation ;degradation ;bacteria ;Guizhou 毒死蜱(Chlorpyrifos ),又名乐斯本(Lorsban ),是美国陶氏化学公司(Dow chemical co.)1962年研制的广谱性有机磷酸酯类杀虫剂,化学成分为O ,O 2二乙基2O 2(3,5,62三氯222吡啶基)硫代磷酸酯,适用于苹果、叶菜、柑橘、棉花、水稻等的害虫防治。
果蔬中残留毒死蜱农药降解菌的选育及鉴定孟庆林;梁金钟;王风青【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)004【摘要】为减少果蔬中残留毒死蜱农药,从长期喷洒有机磷农药的耕地土壤中,筛选到1株能高效降解毒死蜱农药的菌株并编号为DOP-Ma3.对其进行形态学和分子生物学鉴定,结果与GenBank上已提交的16S rDNA进行BLAST比对,由MEGA 6.0软件构建的系统发育树,结果表明该菌株与Burkholderia sp.16S rDNA序列同源性达99％,确定其归属于伯克霍尔德菌属.结合生理生化鉴定结果,确定此菌株为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia).实验证明,该菌株在48 h对500 mg/L毒死蜱降解率为69.87％,其降解酶为胞外酶,在35℃、30 min、pH 7.0条件下,粗酶液添加量为10％,对250 mg/L的毒死蜱进行降解,其降解率为52.47％.经验证,该菌对氧化乐果、氯氰菊酯和敌百虫也有一定的降解能力.【总页数】6页(P108-113)【作者】孟庆林;梁金钟;王风青【作者单位】哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨,150076;哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨,150076;哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨,150076【正文语种】中文【相关文献】1.超声萃取—气相色谱法测定黄瓜中残留的百菌清和毒死蜱 [J], 李非里;孙继万;汪志威2.TurboFlow在线净化/液相色谱-串联质谱法测定水果蔬菜中多菌灵、吡虫啉、啶虫脒与甲基硫菌灵的残留量 [J], 张海超;艾连峰;郭春海;张婧雯;葛世辉;窦彩云;刘慧玲3.气相色谱-四极杆飞行时间质谱准确鉴定常见水果蔬菜中的农药残留 [J], 李晓颍;张红医;常巧英;范春林;庞国芳;曹喆;王雯雯4.果蔬生态清洁素对农产品中残留农药降解效果分析 [J], 蒋俊树;姚彦如;邵栋梁;沈清5.海水养殖环境中拟除虫菊酯类农药降解菌的分离鉴定及降解特性研究 [J], 孙爱丽;刘菁华;史西志;张蓉蓉;肖婷婷;李德祥;陈炯;唐道军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毒死蜱降解菌及其降解机理研究进展武春媛;陈楠;李勤奋;黄星【摘要】毒死蜱是目前广泛使用的有机磷杀虫剂,其残留是食品安全中的一个重要问题,应用微生物降解是消除其残留的有效方法.筛选高效毒死蜱降解菌、构建基因工程菌、提取降解酶,成为国际上解决毒死蜱残留问题的发展方向与研究热点.现已富集分离得到50余株毒死蜱高效降解菌及降解酶制剂配方.笔者重点阐述毒死蜱的微生物降解机理及途径、毒死蜱降解菌的多样性及毒死蜱微生物降解影响因素,并探讨毒死蝉残留控制技术发展趋势.为中国热带地区农产品毒死蜱残留控制研究提供借鉴.%Chlorpyrifos is the most commonly used agricultural insecticide throughout the world and has caused serious food safty issues. Microbial degradation is an effective way of clean-up the pollutant from contaminated soil and of immense importance. More than thirty chlorpyrifos -degrading strains have been isolated from contaminated sites, and some important enzymes capable of degrading chlorpyrifos have been extracted from the isolates in recent years. This review presented a review on mechanisms and pathways of chlorprifos biodegradation, a diversity community of chlorpyrifos-degrading microorganisms, and factors affecting degradation rate. The research prospects were also discussed in this paper.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2011(032)010【总页数】6页(P1989-1994)【关键词】毒死蜂;毒死蜱降解菌;微生物降解;矿化作用;共代谢【作者】武春媛;陈楠;李勤奋;黄星【作者单位】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州 571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州 571737;海南大学环境与植物保护学院,海南海口 570228;海南大学环境与植物保护学院,海南海口 570228;南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】X592毒死蜱 [O,O-二乙基-O-（3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯，Chlorpyrifos]，属高效、广谱、中等毒性有机磷杀虫剂，1965年研制以来广泛用于粮食（水稻、小麦）、蔬菜、果树的病虫害防治，在中国农林业的用量逐年增加。
毒死蜱降解菌的筛选鉴定降解特性摘要[目的]筛选毒死蜱降解菌，了解其特性。
[方法]从常年施用毒死蜱农药的水稻田土壤中筛选出1株能以毒死蜱为唯一碳源和能源的降解菌。
[结果]降解菌DC1对浓度100 mg/L毒死蜱15 d的降解率可达到83.3%。
通过16S rDNA序列同源性和系统发育分析，将该毒死蜱降解菌鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
系统发育表明，该菌和枯草芽孢杆菌的分支特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）的亲缘关系最近。
[结论]降解菌DC1来源于土壤，适应性强，对解决土壤中毒死蜱残留有一定的应用价值。
关键词毒死蜱；生物降解；16S rDNA；枯草芽孢杆菌毒死蜱學名氯吡硫磷，是一种高效、广谱、中等毒性的有机磷酸酯类杀虫杀螨剂，也是目前世界上生产和销售量最大的杀虫剂之一。
在我国，毒死蜱广泛应用于水稻、蔬菜、瓜果类农产品，尤其在禁止甲胺磷、对硫磷等5种高毒农药的销售和使用后，毒死蜱的使用更加广泛和频繁。
然而，农药的实际利用率极低，只有1%～10%施在作物上被利用，其余90%以上的农药或残留于植物和土壤或进入水体[1]。
毒死蜱能够通过皮肤接触或呼吸作用进入人体，并且在人体内有累积现象，影响人的呼吸系统、心血管系统和神经系统，并有一定的致畸性[2-4]。
其在植物和土壤中残留可通过食物链影响人们的健康[5]。
利用微生物降解环境中农药含量是一种高效、安全的方法，目前国内外已有一些关于毒死蜱降解菌的报道。
周淑云[6]从山东泰安某农药厂排污口的土壤中分离到1株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）可降解毒死蜱；张利等[7]从农药厂废水处理池污泥中分离到1株对毒死蜱有较强降解能力的菌株CH3，初步鉴定为哈夫尼菌属（Hafnia sp.）。
笔者以长期施用毒死蜱农药的稻田土壤作为菌种来源，从中筛选出高效降解毒死蜱的菌株，同时因菌种来源于土壤，有较强的适应性能够适应土壤环境，对微生物法降解毒死蜱尤其是解决土壤中毒死蜱残留有较高的应用价值。
专利名称：一种毒死蜱降解菌的分离筛选方法及其应用专利类型：发明专利
发明人：罗鑫,邵彪
申请号：CN201610396469.0
申请日：20160607
公开号：CN106119114A
公开日：
20161116
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种毒死蜱降解菌的分离筛选方法及其应用，经过土壤采集、培养基配制、毒死蜱降解菌的驯化、毒死蜱降解菌的分离、菌株鉴定、菌剂制备和利用菌剂降解毒死蜱步骤，完成对毒死蜱降解菌的分离筛选方法及其应用。
本发明利用以毒死蜱为唯一碳源的无机盐培养基，从常年耕种水稻并频繁使用毒死蜱农药的田间土壤中驯化毒死蜱降解菌，用固体培养基分离降解菌得到单一菌株，对菌株16S rDNA序列进行测序，结合同源性分析和系统发育分析鉴定菌株种属，将该菌种制成菌剂并应用于降解毒死蜱。
申请人：南通市产品质量监督检验所
地址：226000 江苏省南通市港闸区国强路119号
国籍：CN
代理机构：北京一格知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：滑春生
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第26卷第9期2006年9月环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae Circu m stantiaeVol .26,No .9Sep.,2006基金项目:国家自然科学基金项目(No .20277001);安徽省优秀青年基金项目(No .04041067)Supported by the Nati onal Natural Science Foundati on of China (No .20771001)and Excellent Youth Foundati on of Anhui Pr ovince (No .04041067)作者简介:吴祥为(1978—),男,讲师(硕士),E 2mail:wx wahau@ahau .edu .cn ;3通讯作者(责任作者),E 2mail:ri m aohua@ahau .edu .cnB i ography:WU Xiang wei (1978—),male,lecturer,E 2mail:wx wahau@ahau .edu .cn;3Correspond i n g author ,E 2mail:ri m aohua@ahau .edu .cn吴祥为,花日茂,操海群,等.2006.毒死蜱降解菌的分离鉴定与降解效能测定[J ].环境科学学报,26(9):1433-1439W u X W ,Hua R M ,Cao H Q,et al .2006.Is olati on,identificati on and degradati on 2efficiency measure ment of chl or pyrifos 2degradaing bacteria [J ].Acta Scientiae Circum stantiae,26(9):1433-1439毒死蜱降解菌的分离鉴定与降解效能测定吴祥为1,花日茂1,3,操海群1,汤 锋1,李学德1,岳永德21.安徽农业大学资源与环境学院,安徽省“农产品安全”重点实验室,合肥2300362.国际竹藤网络中心,北京100102收稿日期:2005208201 修回日期:2006204214 录用日期:2006204229摘要:取毒死蜱废水处理系统出口处的污泥进行驯化培养,分离出能降解毒死蜱的3株高效降解菌株B 、D 1和D 3,对降解效果最好的D 3菌株经中科院微生物研究所鉴定为玫瑰红红球菌(R hodococcus rhodochrous );3株菌株的生长情况及对毒死蜱的降解动力学研究表明,B 菌株在第3天繁殖增量达到最大,D 1、D 3菌株在第4天繁殖增量达到最大,B 、D 1和D 3菌株的最适宜生长温度都是在30℃;采用10mg ・L -1毒死蜱作为唯一碳源时,B 、D 1和D 3菌株对毒死蜱的降解速率分别为0.0543、0.0479和0.0620h -1;对于浓度为10mg ・L -1的毒死蜱,D 3菌投入的初始菌量OD 223为0.4是最适宜的;D 3菌对不同初始浓度的毒死蜱降解表明,初始浓度增大,降解速率降低,半衰期延长.关键词:毒死蜱;分离鉴定;降解;高效液相色谱文章编号:025322468(2006)0921433207 中图分类号:X172 文献标识码:AIsol a ti on,i den ti f i ca ti on and degrada ti on 2eff i c i ency m ea surem en t of chlorpyr i fos 2degrada i n g bacter i aWU Xiang wei 1,HUA R i m ao1,3,CAO Haiqun 1,T ANG Feng 1,L I Xuede 1,Y UE Yongde21.College of Res ources and Envir onment Anhui Agricultural University,The Key Laborat ory of Anhui Agri 2f ood Safety,Hefei 2300362.I nternati onal Centre for Ba mboo &Rattan,Beijing 100102Rece i ved 1August 2005; rece i ved in revised f or m 14Ap ril 2006; accepted 29Ap ril 2006Abstract:Three bacterial strains that had a capability t o utilize chl or pyrif os as the s ole carbon and energy s ourceswere is olated fr om the sludge .Based on the mor phol ogy and physi o -bi ochem ical p r operties,the strain D 3which had the best degradati on capability t o chl or pyrif os was identified as Rhodococcusrhodochrous by I nstitute of M icr obi ol ogy Chinese Academy of Sciences .The bi omass got t o the maxi m um when strain B was cultivated f or 3d,howeverstrains D 3and D 1need 4d .The op ti m al cultivating te mperature of all the strains was 30℃.I n aqueous s oluti on of chl or pyrif os at the concentrati on of 10mg ・L -1,the degradati on rate constants of strains B,D 1and D 3utilizing chl or pyrif os as the s ole carbon s ource were 0.0479,010543and 010620h -1,res pectively .It was op ti m al that the OD 223of strain D 3s oluti on attained 0.4for the degradati on of chl or pyrifos at the concentrati on of 10mg ・L -1.The results als o showed that the degradati on efficiency of the strain D 3t o chl or pyrif os decreased with initial concentrati on of chl or pyrif os increasing .Keywords:chl or pyrif os;is olati on and identificati on;degradati on;HP LC1 引言(I ntr oducti on )化学农药主要是人工合成的生物外源化学物质,许多类型通常不易被生物降解,故称之为顽固性化合物(Recalcitrants )(王保军等,1998).大量研究证实微生物对土壤和水环境中的农药降解和污染消除起着重要作用,且已分离到一些能降解或转化农药的微生物类群.毒死蜱(chl or pyrifos ),化学名称:O,O —二乙基—O —(3,5,62三氯—22吡啶基)硫逐磷酸酯,是美国陶氏化学公司(Dow Che m ical Co .)于1965年开发并研制出来的一种广谱性有机磷酸酯类杀虫剂,被广泛用于农业和城市卫生害虫的防治(刘乾开,1993;吴慧明等,2003).目前,国内外关于毒死蜱的环 境 科 学 学 报26卷研究报道主要集中在毒死蜱用于农业害虫防治时在环境中的行为规律.Racke 等(1994)研究认为毒死蜱在土壤中降解的主要产物是3,5,62三氯—22吡啶醇(T CP ),但T CP 的进一步降解要缓慢得多;L iu 等(2001)研究了Chesapeake Bay 地区4条支流自然水中毒死蜱的水解,水的盐度在0～17‰之间时,水解半衰期从24d 到126d 不等,毒死蜱的水解受pH 、水中的盐度、Cu 2+等成分的影响;光解研究发现土壤质地和土壤湿度对毒死蜱在土壤表面的光解有重要的影响(岳永德等,2002).目前已有一些关于毒死蜱降解菌的报道(王金花等,2005;刘新等,2003).本研究利用农药厂生产废水处理系统出口处的污泥进行驯化培养,拟从中分离出高效降解菌并研究其对毒死蜱在水中的生物降解特性,旨在寻找有价值的毒死蜱降解菌,为农药的环境生物治理提供技术支撑.2 实验部分(Experi m ents )2.1 污泥来源污泥取自江苏宝灵化工股份有限公司毒死蜱的生产废水处理系统出口处.2.2 培养基的制备基础培养基:0.4g MgS O 4・7H 2O,0.002g FeS O 4・7H 2O,0.2g K 2HP O 4,0.2g (NH 4)2S O 4,0.08g CaS O 4,1L 蒸馏水,pH 7.0～7.2.富集培养基:3g 牛肉膏,5g 蛋白胨,5g 氯化钠,1L 蒸馏水,pH 7.0～7.2.牛肉膏蛋白胨培养基:3g 牛肉膏,5g 蛋白胨,5g 氯化钠,15g 琼脂,1L 蒸馏水,pH 7.0～7.2.上述3种培养基均在121℃下高压蒸汽灭菌锅中灭菌30m in .2.3 降解菌的驯化培养参考瓶培养法富集技术(venkales warlu K,1997;[日]土壤微生物研究会,1983).取污泥1g,加入40mL 含毒死蜱浓度为25mg ・L -1基础培养基,置于30℃、120r ・m in -1的摇床中培养1周;以后每周取出上周的培养混合液4mL 加到40mL 基础培养基中,毒死蜱浓度每周增加25mg ・L -1,且每周添加的新污泥比上周减少0.25g,至毒死蜱添加浓度达到125mg ・L-1,新污泥减少到0g 为止;再经1周后,取出4mL 培养混合液加到40mL 基础培养基中,毒死蜱添加浓度为150mg ・L-1,不再添加污泥,以后每周取出上周的培养混合液4mL 加到40mL基础培养基中,毒死蜱浓度每次增加25mg ・L -1,至毒死蜱的添加浓度达200mg ・L -1,并保持200mg ・L -1持续2周.至此驯化结束.2.4 降解菌的分离、纯化(陈绍铭等,1985;沈萍等,1999) 采用十倍稀释平板法,在含有5mg ・L -1毒死蜱的牛肉膏蛋白胨培养基上进行划线分离,然后根据不同外观形态挑取单菌落反复划线分离,并根据各菌落的外观形态特征和在油镜下观察细胞形态特征合并相同的菌落.2.5 高效降解菌的确定将上述分离纯化后的菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基,培养24h 后,加入5mL 的无菌水制成菌悬液,用灭菌的移液枪吸取0.1mL 菌悬液加入到盛有5mL 浓度为25mg ・L -1毒死蜱基础培养基的试管;对照组中加同样量的无菌水,于30℃恒温摇床培养箱(120r ・m in -1,30m in,3次・d -1)培养24h .提取分析:在培养液试管中加入5mL 乙腈,提取后过0.45μm 的细菌过滤器,HP LC 检测毒死蜱的剩余量.比较毒死蜱的残存量以确定高效降解菌株.2.6 高效降解菌的鉴定形态特征和生理生化特征由中科院微生物研究所鉴定.2.7 高效降解菌的温度生长曲线菌悬液制备:将已活化筛选出来的菌株接种于富集培养基中,于30℃恒温摇床培养箱(120r ・m in-1,30m in,3次・d-1)培养24h,5000r ・m in-1离心15m in;弃取上清液,收集菌体,将菌体用磷酸缓冲液(pH =7.2,0.2mol ・L -1磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液)洗涤2次,然后再用该缓冲液制成菌悬母液.将菌悬液接种于含毒死蜱浓度为10mg ・L -1的基础培养基,接种的初始菌量OD =0.05,分别在20、25、30、35、40℃的不同恒温摇床培养箱中(120r ・m in-1,30m in,3次・d-1)培养,3d 后测定吸光度值.2.8 高效降解菌的时间生长曲线菌悬液制备同1.7节.将菌悬液接种于含毒死蜱浓度为10mg ・L -1的基础培养基,接种的初始菌量OD =0.05,于30℃恒温摇床培养箱(120r ・m in-1,30m in,3次・d-1)培养,分别在1、2、3、4、5、43419期吴祥为等:毒死蜱降解菌的分离鉴定与降解效能测定6d 取样,测定其吸光度值.2.9 高效降解菌的降解动力学2.9.1 不同菌株的降解动力学 吸取0.5mL 浓度为100mg ・L -1毒死蜱的丙酮母液到试管中,用氮吹仪吹干,加入不同菌株菌悬母液,再用基础培养液加到5mL,使整个反应溶液体系的OD 值为0.4,毒死蜱的浓度为10mg ・L -1,同时设置不加菌的对照组.然后于30℃恒温摇床培养箱(120r ・m in -1,30m in,3次・d -1)培养,于不同时间点取样分析.2.9.2 初始菌量对毒死蜱的降解作用 同2.9.1方法,使毒死蜱浓度为10mg ・L -1的反应溶液体系初始菌量OD 值分别为0.4、0.6、0.8,同时设置不加菌对照组.然后于2.9.1节条件下培养与分析.2.9.3 D 3菌株对不同浓度的毒死蜱的降解作用 同2.9.1方法,分别使毒死蜱的浓度分别为5、10、20mg ・L -1反应溶液体系OD 值为分别为0.2,同时设置不加菌作为对照.然后于2.9.1节条件下培养与分析.2.10 毒死蜱测定条件和数据处理分析高效液相色谱分析条件:Agilent11002HP LCHypersil ODS 柱(4.6mm ×250mm ,5μm );可变波长紫外检测器,检测波长:230nm;流动相:乙腈∶水的体积比为90∶10;流速:1.0mL ・m in -1;柱温:室温;手动进样,进样量20μL.试验结果运用SPSS11.0软件进行统计分析,用SSR 测验法进行多重比较.3 结果(Results )3.1 高效降解菌的确定驯化结束后,通过稀释平板法,分离得到19株菌株,标记为A 、A 1、A 2、A 3、B 、B 1、B 2、B 3、C 、C 1、C 2、C 3、D 、D 1、D 2、D 3、E 、E 1、E 2.在相同的条件下降解毒死蜱,24h 后提取上述19株菌株降解毒死蜱的溶液,通过高效液相色谱分析,发现有3株菌株降解效果较好,标记为B 、D 1、D 3,降解效果如表1和图1.由图1和表1可知,降解效果最好的是D 3菌株,反应24h 后,25mg ・L -1毒死蜱的去除率为81.8%,其次是B 菌株和D 1菌株.从图谱上可以看出4.2m in 处有毒死蜱降解产物峰.图1 不同菌株对毒死蜱的降解高效液相色谱图Fig .1 HP LC chr omat ogra m s of chl or pyrif os on degradati on of different is olated strains5341环 境 科 学 学 报26卷表1 不同菌株对毒死蜱的降解效果Table1 Degradati on rati o of different is olated strains on degradati on of chl or pyrifos菌株降解率1)菌株降解率1)菌株降解率1)A 2.67ij B324.07f D241.08dA10.28j C36.20e D381.80a A2 3.24ij C10.59j D 5.49iA39.40h C2 1.10j E19.63ghB77.48b C313.2g E20.30jB120.62f D 5.49iB212.26gh D170.46c 注:1)数据之间的显著性差异用Duncan检验,数据上标的字母不同表示处理间差异显著,字母相同表示处理间差异不显著,p< 0105,SE=1.209.(The difference a mong treats tested by One-way AVONA,numbers that on the sa me r ow foll owed by different letters were significantly different at p<0.05).3.2 高效降解菌的鉴定D3菌株在显微镜下观察呈杆状,不运动,侧面有分支菌丝;在完全培养基上,菌落粘质、圆形、全缘、表面湿润、隆起、紫红色、不透明;革兰氏呈阳性,接触酶呈阳性、氧化酶呈阴性,不能利用大多数碳水化合物,脂酶呈阳性.D3菌株经中科院微生物所鉴定为玫瑰红红球菌(R hodococcus rhodochrous),其主要鉴定特征见表2所示.表2 菌株D3的生理生化特征Table2 Physi o2bi oche m ical characteristics of is olated strain D3试验项目Tests 结果Results试验项目Tests结果Results试验项目Tests结果Results试验项目Tests结果Results革兰氏染色阳性接触酶+氧化酶-细胞形状杆状对照-a2D2乳糖-塔格糖-L丙氨酰胺-a2环糊精-Lactul ose-D2海藻糖+w D2丙氨酸-b2环糊精-麦芽糖-松二糖-L2丙氨酸-糊精+麦芽三糖-木糖醇+L2丙氨酰苷氨酸-糖原-D2甘露醇+w D2木糖+w L2天冬酰胺-菊粉-D2甘露糖+乙酸+L2谷氨酸-甘露聚糖-松三糖+w a2羟基丁酸+甘胺酰谷氨酸-T ween40+D2蜜二糖-b2羟基丁酸+焦谷氨酸-T ween80+a2甲基半乳糖苷-g2羟基丁酸-L2丝氨酸-N2乙酰葡萄糖胺-b2甲基半乳糖苷-扁桃酸-腐氨+w N2乙酰甘露糖胺-32甲基—D2葡萄糖-a2氧代戊二酸+2,32丁二醇-苦杏仁苷-a2甲基葡糖苷-a2酮戊酸+甘油-L2阿拉伯糖-b2甲基葡糖苷-乳酰胺+腺苷-D2阿糖醇-a2甲基甘露糖苷-乳酸甲酯+22脱氧腺苷-熊果苷-Palatinose+L2乳酸+肌苷-D2纤维二糖-D2阿洛酮糖+D2苹果酸+w胸苷-D2果糖+D2棉子糖-L2苹果酸+尿苷-岩藻糖-L2鼠李糖+w丙酮酸甲酯+腺苷酸-D2半乳糖-D2核糖+丁二酸一甲酯+胸苷酸-半乳糖醛酸-水杨苷-丙酸-尿苷酸-龙胆二糖-景天庚酮聚糖+w丙酮酸+D2果糖262磷酸+w D2葡萄酸-D2山梨醇-琥珀酰胺酸+w D2葡糖-1-磷酸+w a2D2葡萄糖+水酥糖-丁二酸-D2葡糖262磷酸-m2肌醇-蔗糖-N2乙酰谷胺-D,L2甘油磷酸- 注:+表示90%～100%菌株反应阳性;-表示90%～100%菌株反应阴性;+w表示弱反应.Note:The sign"+","-","+w"mean90%～100%strains negative reacti on,90%～100%strains positive reacti on and weak reacti on, res pectively.63419期吴祥为等:毒死蜱降解菌的分离鉴定与降解效能测定3.3 不同培养温度和不同培养时间下B 、D 1、D 3菌株生长情况不同培养温度和时间下3株菌株的生长变化情况如图2所示.由图2可知,3株菌株都是在30℃下吸光度值达到最大,即30℃是其生长最适宜的温度;B 菌株在培养3d 时繁殖增量达到最大,D 1菌株和D 3菌株都是在培养4d 时繁殖增量达到最大,超过最大量以后都进入衰退期.图2 不同培养温度和时间下B 、D 1、D 3菌株生长曲线(a .温度,b .时间)Fig .2 The gr owth curves of is olated strains at different cultivatingte mperature and ti m e (a .te mperature,b .ti m e )3.4 降解菌的降解动力学3.4.1 不同菌株的降解动力学 在相同条件下,通过B 、D 1、D 3菌株对于10mg ・L -1毒死蜱的降解动力学研究考察了3个菌株对毒死蜱的降解能力,结果见表3.B 、D 1、D 3菌株对毒死蜱的生物降解半衰期分别为12.76、14.47、11.17h .3株菌株降解毒死蜱能力在α=0.05的显著水平上存在明显差异,降解效能大小分别为:D 3菌株>B 菌株>D 1菌株.3.4.2 初始菌量对毒死蜱降解动力学的影响 在毒死蜱浓度为10mg ・L -1,初始菌量OD 223分别为014、0.6、0.8的条件下,D 3菌对毒死蜱的降解率随时间延长而增加,降解的动力学参数见表4.降解规律符合一级动力学方程,R 2均在0.95以上;菌量OD 223分别为0.4、0.6、0.8时,速率常数分别为010613、0.0655、0.0730h-1,半衰期分别为11.31、10.58、9.49h,经差异显著性分析,在菌量OD 223为0.4和0.6的情况下,半衰期差异不显著;菌量OD 223为0.8的半衰期与菌量OD 223为0.4、0.6的差异显著.从节约菌量角度来考虑投入初始菌量和降解效能的关系,10mg ・L -1的毒死蜱投入的初始菌量OD 223为0.4是适宜的.表3 不同菌株对毒死蜱降解动力学的影响Table 3 Effect of different is olated strains on degradati on kinetics ofchl or pyrif os 菌株Strains一级动力学方程First order kinetic equati on C t =C 0e -ktR 2Decisive coefficient k /h -1Rate constant 半衰期1)/hHalf 2lifeB C t =9.0761e -0.0543t 0.98500.054312.76b D 1C t =9.0138e -0.04793t 0.97200.047914.47c D 3C t =9.0441e -0.0620t0.98760.062011.17a 注:1)数据之间的显著性差异用Duncan 检验,同一列的数据上标的字母不同表示处理间差异显著,p <0.05,SE =0.187.(The difference a mong treatstested by One -way AVONA,nu mbers that on the same r ow f oll owed by different letters were significantly different at p <0.05).表4 D 3菌株不同菌量对毒死蜱的降解动力学的影响Table 4 Effect of different bi omass on bi odegradati on kinetics of chl or pyrifos by strain D 3菌量B i omass 一级动力学方程First order kinetic equati onC t =C 0e -k tR 2Decisive coefficientk /h -1Constant rate 半衰期1)/h Half 2lifeOD 223=0.4C t =8.3801e -0.0613t0.95140.061311.31b OD 223=0.6C t =8.3446e -0.0655t0.95250.065510.58b OD 223=0.8C t =8.5294e -0.0730t0.97650.07309.49a 注:1)数据之间的显著性差异用Duncan 检验,同一列的数据上标的字母不同表示处理间差异显著,字母相同表示处理间差异不显著,p <0.05,SE =0.200.(The difference a mong treats tested by One 2way AVONA,numbers that on the sa me r ow foll owed by different letters were significantly different at p <0.05).7341环 境 科 学 学 报26卷3.4.3 不同初始浓度对毒死蜱降解动力学的影响 在培养温度为30℃,初始菌量OD223=0.2时,不同初始浓度毒死蜱的降解动力学参数和降解动态见表5和图3.由表5可知,初始浓度为5、10、20 mg・L-1毒死蜱的降解速率常数分别为0.0565、010421、0.0378h-1,其半衰期逐渐增大,分别为12127、16.46、18.33h.半衰期经差异显著性分析,在α=0.05显著水平上,D3菌对不同初始浓度毒死蜱的降解能力存在明显差异,也即是从低浓度到高浓度降解效能逐渐下降.表5 D3菌株对不同浓度毒死蜱的降解动力学的影响Table5 Effect of different concentrati on chl or pyrif os on bi odegradati on kinetics by strain D3初始浓度/I nitial concentrati on(mg・L-1)一级动力学方程First order kinetic equati onC t=C0e-k tR2Decisive coefficientk/h-1Constant rate半衰期1)/hHalf2life 5C t=3.3377e-0.0565t0.84460.056512.27a10C t=8.3293e-0.0421t0.88610.042116.46b20C t=20.108e-0.0378t0.94210.037818.33c 注:1)数据之间的显著性差异用Duncan检验,同一列的数据上标的字母不同表示处理间差异显著,p<0.05,SE=0.268.(The difference among treats tested by One-way AVONA,numbers that on the sa me r ow foll owed by different letters were significantly different at p<0.05).图3 D3菌对不同浓度毒死蜱降解动态Fig.3 B i odegradati on kinetics of different concentrati onchl or pyrifos by strain D34 讨论(D iscussi on)关于毒死蜱降解菌的降解能力已有相关报道(王金花等,2005;刘新等,2003),其降解能力在快速降解毒死蜱上与本文筛选的菌株有一定的差距,如报道的真菌W Z2Ⅰ、W2Ⅱ、W Z2Ⅲ降解初始浓度为10mg・L-1的毒死蜱,5d后降解率分别为80%、80%、50%左右,而本文筛选的B、D1、D3菌降解同样浓度50%的毒死蜱只要12.76、14.47、11.17h.通过驯化培养,本文分离出3株高效降解菌,对其中降解效果最好的高效降解菌经中科院微生物所鉴定表明,D3菌株为玫瑰红红球菌(R hodococcusrhodochrous).该菌株在基础培养基中对毒死蜱有较强的降解能力,对于加快水中毒死蜱的去除具有重要的意义,但其能否应用于自然水体中加速毒死蜱的降解等问题仍需试验探讨.在生物降解过程中,培养条件对微生物降解速率有很大影响,只有在适宜条件下,微生物才能充分发挥其降解能力.实验研究得出投入菌量OD223为0.4时对于10mg・L-1的毒死蜱是比较适宜的.农药的微生物降解实质是酶促反应,这些酶是微生物固有的,或是由于变异产生的(A shvini et al.,2000).酶代谢的途径包括:(1)广谱性酶的偶然代谢,如水解酶、氧化酶等;(2)基质结构与农药相似的酶进行的共代谢;(3)利用农药作为能源适应酶进行的降解代谢.D3菌株能够降解毒死蜱,可能是因为其体内存在可以分解毒死蜱的酶,有研究表明降解酶往往比微生物本身更具有好的降解效果(Str ong eta l.,2000);因此,D3菌生物量的改变,可能导致降解毒死蜱酶的改变,从而影响毒死蜱的降解效能.不同初始浓度毒死蜱降解结果说明了微生物对一定浓度的毒死蜱保持较强的降解作用,这一结果与前人报道相似(王金花等,2005;刘新等2003).随着毒死蜱浓度的增加,D3菌株对毒死蜱的降解效率下降,即基质浓度满足降解菌的要求后,再增加基质对降解速率没有贡献,对于一定量的菌来说,只能降解一定量的农药.5 结论(Conclusi ons)1)通过污泥驯化培养,分离出3株能够降解毒死蜱的菌株,降解效果最好D3菌株经鉴定为玫瑰红红球菌(R hodococcus rhodochrous).2)3株菌株对毒死蜱在水中的微生物降解遵从一级动力学规律,研究得出玫瑰红红球菌对浓度为10mg・L-1毒死蜱生物降解的最佳初始菌量是OD223为0.4;OD223为0.2的初始菌量只能快速降解5 83419期吴祥为等:毒死蜱降解菌的分离鉴定与降解效能测定mg・L-1的毒死蜱,过多毒死蜱不利于快速降解.责任作者简介:花日茂,男,安徽农业大学资源与环境学院副院长,教授,博导.现主要从事环境污染修复和农药残留研究,主持完成和在研的项目有国家自然科学基金、国家“十五”科技攻关重大专项、国家“863”、安徽省“十一五”科技攻关和安徽省优秀青年基金等,获多项成果奖和专利,主编专著2部,发表论文100余篇.E2mail:ri m aohua@References:A shvini C,A sit K C,Rakesh K J.2000.Plas m id2encoded Degradati onof p2N itr ophenol and42N itr ocatechol by A rthr obacter Pr ot ophor m iae [J].B i ochem.B i ophys Res Commun,270:733—740Chen S M,Zheng F S.1985.Experi m entati on of water m icr oorganis m s (1st volume)[M].Beijing:Ocean Press,43—46(in Chinese) [Japan]Edaphon Se m inar Edited.1983.Experi m entati on of Edaphon 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