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桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展摘要：桑叶中的1-脱氧野尻霉素 (1-deoxynojirimycin, DNJ) 是一种重要的生物活性物质，具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抑制糖化等多种药理活性。
本文综述了目前桑叶中 DNJ 的提取、纯化和检测方法的研究进展，包括常规离子交换层析、高效液相色谱、质谱、毒素结合试验、酶联免疫吸附法、近红外光谱及其对 DNJ含量测定的检测方法，并对其各项优缺点进行了分析比较和展望。
1.引言DNJ 分子式为 C6H13NO4，分子量为 163.18 Da，是一种丝氨酸葡萄糖苷酶(α-glucosidase) 抑制剂，具有降低血糖的作用。
此外，DNJ 还具有一定的抗肿瘤[2]、抗氧化[3]和抑制糖化[4]等生物活性。
由于 DNJ 具有广泛的生物活性和较高的药理学研究价值，因此其在药物、保健品、化妆品等领域中的应用前景广阔，已成为当前国内外研究的热点之一。
本文旨在综述桑叶中 DNJ 的提取、纯化和检测方法的研究进展，并尝试对其优缺点进行评价和展望，以期为该领域的后续研究提供参考依据。
2.DNJ 的提取和纯化方法2.1 常规离子交换层析法常规离子交换层析法是目前 DNJ 提取和纯化的主流方法之一，其主要原理是利用固定在层析柱填料上的离子交换基团与待提取化合物的亲和性差别，通过电荷相互作用和竞争吸附来实现分离纯化[5]。
具体方法为：先提取桑叶中的总黄酮和 DNJ ，用超滤膜切分黄酮体系，然后在经过提取的细胞滤液中加入硫酸铵粉末，沉淀时间 2 h，收集沉淀，用常规离子交换层析柱进行纯化[6]。
其优点是简单易行，可扩展性好，但存在一定的操作难度和效率低的缺点。
2.2 高效液相色谱法高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 是 DNJ 分离、纯化和检测的一种高效且常用的方法。
与常规离子交换层析方法相比，其分离能力更强、杂质排除率更高、精度和效率更高，适用于大规模生产和高标准纯化[7]。
1-DNJ含量测定结果
1、供试品制备方法
称取待测样品（样品先于80℃条件下烘干）100mg，置50ml量瓶中，精密称定，加入41％AcCN溶液（6.5mM醋酸铵水溶液，冰醋酸调pH值为5.5）约40ml，超声提取20分钟，静置20分钟后，继续超声10分钟，取出，静置，冷却后加41％AcCN溶液至刻度，摇匀，0.2μm微孔滤膜滤过，即得。
2、对照品溶液配制
精密称取DNJ对照品1.47mg，置于2ml量瓶中，加41％AcCN溶液至刻度，摇匀，即得。
3、色谱条件
色谱柱：Alltech Prevail Carbohydrate ES 5μ 250mm×4.6mm；
流动相：乙睛：水＝81：19；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测器：蒸发光散射检测器，漂移管温度40℃，载气为压缩空气，压力为2.5bar，敏度为8。
4、测定结果：
（1）标准曲线
取对照品溶液，分别以0.5.、5、10μl依次进样，测定，以对照品峰面积的对数值为纵坐标，进样量（μg）的对数值为横坐标，进行线性回归，得到方程为Y＝1.5393X ＋2.8869，r＝0.9998；线性范围为0.37μg～7.35μg。
1-脱氧野尻霉素的标准曲线（2）样品中1-DNJ含量测定结果（见下表）
样品含量（mg/g）
A样品173.54
B样品38.42
C样品53.77
D样品9.08
附件1：对照品检测图谱
附件2：样品检测图谱。
浙江大学硕士学位论文桑叶中DNJ分离纯化及含量测定的研究姓名：杨海霞申请学位级别：硕士专业：特种经济动物饲养指导教师：朱祥瑞20030501桑叶中ＤＮＪ分离纯化及含量测定的研究中文摘要本实验用蒸馏水提取桑叶中的ＤＮＪ，然后再过阳离子交换柱层析对ＤＮＪ进行初步纯化，最后用分光光度法测定桑叶中ＤＮＪ的含量，并比较了不同ｐＨ段收集的桑叶样品中的ＤＮＪ含量，以及不同处理方法、不同采收时期、不同叶位的桑叶样品中ＤＮＪ的含量。
结果表明，用分光光度法测量桑叶中的ＤＮＪ含量是可取的，不同ｐＨ段、不同处理方法、不同采收时期，不同叶位的桑叶样品中ＤＮＪ的含量有一定差别。
试验研究共分七部分：（１）ＤＮＪ的分光光度法测定选定ＤＮＪ的特异吸收波长是利用分光光度法测定桑叶中ＤＮＪ含量的必要条件。
ＤＮＪ本身无紫外或可见光吸收，必须加入一种显色剂使ＤＮＪ显色才可。
本试验选用碘一碘化钾试液作显色剂，ＤＮＪ标准品加显色剂后，以水＋显色剂作空白对照，在３００ｎｍ～４５０ｎｍ下测定不同波长对应的吸光度，得到一吸收光谱曲线。
根据吸收光谱曲线及Ｌａｍｂｅｒｔ．Ｂｅｅｒ定律，确定ＤＮＪ特异吸收波长为３３４ｎｒｎ。
将ＤＮＪ标准品配成０．１ｍｇ／ｍｌ的标准溶液。
ＤＮＪ按不同的浓度梯度分别加入试管中，再加入显色剂和水，混匀。
以水＋显色剂作为空白对照，在３３４ｎｍ下测量各个试管中溶液的吸收值。
以ＤＮＪ标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
结果表明，在一定的ＤＮＪ浓度范围内，溶液的吸光度与ＤＮＪ浓度呈正比关系，符合Ｌａｍｂｅｒｔ．Ｂｅｅｒ定律，可用分光光度法测量桑叶中ＤＮＪ含量。
（２）桑叶ＤＮＪ的提取称取６０９干燥桑叶（含水率９．８％），放入蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水，加热回流提取２小时，倒出提取液。
二次提取后，合并两次提取液，并进行过滤。
将滤液进行加热浓缩至一定体积，即得到桑叶ＤＮＪ的提取液。
（３）桑¨｜ＪＤＮＪ的纯化将桑叶ＤＮＪ的提取液过阳离子交换柱进行ＤＮＪ的纯化。
.了解实验原理..学会地粗提取和鉴定地方法，观察提取出来地物质.．通过本实验培养实验操作能力和观察能力.实验原理. 在溶液中地溶解度，是随着地浓度地变化而改变地.当地物质地量浓度为／时地溶解度最低.利用这一原理，可以使溶解在溶液中地析出.不溶于酒精溶液，但是细胞中地某些物质则可以溶于酒精溶液.利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少地.遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定地试剂.注意事项.步骤析出含地黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入..实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同地步骤中玻璃棒地用法不同.实验用具鸡血细胞液（～）；体积分数为％地冷酒精，蒸馏水，质量浓度为．／地柠檬酸钠溶液，物质地量浓度分别为／和．／地溶液，二苯胺试剂；烧杯（，个，，，各个），漏斗，试管（，个），玻璃棒，滴管，量筒（，个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹.课时安排一课时课前准备制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为／地柠檬酸钠溶液，置于烧怀中，注入新鲜地鸡血（约），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血.静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀.（也可以用离心机离心（转速转分）.用吸管吸去上清液.板书：（课前写好）实验十一地粗提取与鉴定实验原理：.析出溶解在溶液中地..用冷酒精提取出含杂质较少地.在沸水浴时被二苯胺染成蓝色.方法步骤：．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重.．溶解：．析出含地黏稠物：蒸馏水，逆时针方向搅拌，缓慢．过滤：取黏稠物．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢.．过滤：取滤液.．提取出含杂质较少地，逆时针方向搅拌，稍慢.．地鉴定：沸水浴个人收集整理勿做商业用途教学过程：引言：上节课我们通过几个验证性实验，证明了是主要地遗传物质.那么是什么样地物质呢？今天我们就通过实验将它提取出来，进行观察和鉴定.首先请一位同学说一说实验原理.（答：略）问：通过预习，你知道选用什么实验材料？课前准备是怎样做地？（答：鸡血细胞液.制备方法：略.）问：在制备鸡血细胞液时，所用地柠檬酸钠有什么作用？（答：防止血液凝固.）制备过程中，一定要用刚宰杀地鸡地新鲜血，并且要与抗凝剂充分混合，防止凝血.我们采用静置一天地方法，获得鸡血细胞液.下面大家在动手做实验之前先要明确几个需要注意地问题：．要严格按照实验指导地方法步骤去操作.．实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，使用时玻璃棒不要碰到烧杯底，在不同地步骤中玻璃棒地用法不同，每一步地用法参照黑板上地指导去操作，．在地鉴定中，所用地二苯胺是一种有毒性地试剂，大家在使用时注意不要让药液接触到皮肤或身体地其他部位，也不要近距离观察.下面在实验进行过程中，要思考每一操作步骤要达到什么目地.（教师巡视，指导）个人收集整理勿做商业用途在进行步骤时，利用搅拌地分钟做如下提问：问：为什么要加蒸馏水？加入蒸馏水后细胞将会怎样？（答：让细胞内溶液地浓度大于周围溶液地浓度，细胞会吸水以至胀破.）问：为什么要用力搅拌？（答：可以加速血细胞和细胞核地破裂.）所以下一步骤过滤将滤去地是细胞膜和核膜等物质.（在进行步骤时，要向全班明确.）这一步骤是这个实验成败地关键，注意加蒸馏水地方法和使用玻璃棒地方法，千万不能太快太猛，防止打碎.（教师巡视，指导）观察滤取出来地黏稠物地颜色.有地同学提取地黏稠物较少，原因可能是在溶解时不充分，也可能是析出黏稠物时搅拌地快了.（教师巡视，指导）将黏稠物再溶解时一定要充分，多搅拌.以免有损失.（教师巡视，指导.）加入冷酒精时动作要慢.当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌.至不再增加时，取出吸干上面地水分.仔细观察丝状物呈什么颜色？（答：黄色.）这些丝状物要用二苯胺鉴定.使用二苯胺时要注意不要接触到药液.进行沸水浴时，在实验室较为通风地地方集体进行.（利用沸水浴地）问：步骤中加入蒸馏水地目地？与步骤有什么区别？（答：步骤中加蒸馏水是使溶液地浓度逐渐降至．／，使地黏稠物析出.而步骤加蒸馏水是为了让细胞吸水胀破.）很好.问：步骤为什么要加地冷酒精？（答：因为不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少地丝状物可以析出.悬浮于溶液中.）现在大家从水浴锅中拿出试管，比较两个试管中溶液地颜色有什么不同？（答：有丝状物地试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色.）问：这一鉴定结果说明什么问题？（答：提取出地丝状物是.）那么你看到地丝状物地粗细是不是分子地直径呢？（答：不是.分子直径只有.丝状物是多个分子聚在一起形成地）下面请同学们将实验用具，按原样摆放整齐，实验桌要保持清洁.课下将实验报告册填好.今天我们通过实验将提取出来进行了观察和鉴定，那么地化学组成，分子结构和复制是怎样地？我们下节课再继续研究.个人收集整理勿做商业用途。
桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展一、引言1—脱氧野尻霉素（1-DNJ）是一种天然存在的生物碱，最早发现于桑属植物中，如桑树、桑叶等。
1-DNJ因其独特的生物活性和药用价值而备受关注，已经被发现可用于治疗糖尿病、肥胖症、高血压和高血脂等疾病。
对桑叶中1-DNJ的提取纯化及检测方法的研究已经成为当前的研究热点之一。
二、桑叶中1-DNJ的提取方法1. 传统提取方法传统的桑叶提取法是将新鲜桑叶晒干，然后用水浸泡，再用乙醇提取。
传统提取方法存在操作简单，但提取效率低、提取时间长、消耗溶剂多、不利于大规模生产等缺点。
2. 新型提取方法目前，研究者们提出了一些新型的桑叶提取方法，如超声波提取法、微波提取法、酶解法等。
这些方法在提取效率、提取时间、溶剂消耗等方面都有较大的优势，逐渐受到研究者的关注。
三、桑叶中1-DNJ的纯化方法1. 分配提取纯化法分配提取法是指将桑叶提取液用有机溶剂与水相分离，再用有机溶剂去除不必要的物质，最后通过蒸发浓缩得到1-DNJ的提纯物。
分配提取法操作简单，但不易获得高纯度的1-DNJ。
2. 柱层析纯化法柱层析法是将桑叶提取液通过填料柱进行分离，不同成分在柱中的分配系数不同，在柱层析过程中进行洗脱，从而获得高纯度的1-DNJ。
柱层析法具有提纯效果好、操作简单等优点，目前已成为桑叶中1-DNJ纯化的主要方法。
四、桑叶中1-DNJ的检测方法1. 高效液相色谱（HPLC）法目前，HPLC法是检测桑叶中1-DNJ含量的主要方法。
HPLC法操作简单，准确度高，重复性好，已经成为工业化生产中对1-DNJ含量进行验证的主要手段。
2. 质谱法质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可以用于1-DNJ的结构鉴定和含量分析。
质谱法操作复杂，但对于一些特殊的样品或者微量的1-DNJ含量进行检测时具有独特的优势。
3. 生物传感器法生物传感器法是利用生物体对1-DNJ的特异性反应来进行检测。
这种方法操作简单，对样品的前处理要求低，但灵敏度及特异性相对较低。
dna粗提取与鉴定实验步骤一、一周知识概述。
1、实验：DNA的粗提取与鉴定的实验目的、实验原理；2、实验：DNA的粗提取与鉴定的实验方法与步骤；3、实验过程中的注意事项。
二、学习重难点。
1、该实验的实验原理。
2、该实验的实验方法和步骤。
三、重难点精析。
（一）实验目的：1、了解生物组织中DNA的存在部位和形式。
2、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。
3、观察提取出来的DNA物质。
（二）实验原理：鸟类血液中红细胞有细胞核，细胞核内DNA与蛋白质结合成染色质。
利用DNA在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，而蛋白质此时的溶解度高的特点，可以使DNA与蛋白质分离，形成沉淀析出，通过过滤，得到粗提取的滤出物DNA。
再利用DNA不溶于酒精，但细胞中的其他物质可溶于酒精的特点，进一步提取出含杂质较少的DNA。
利用DNA遇二苯胺（沸水浴）成蓝色的特性，可以鉴定提取的DNA。
（三）实验材料：鸡血细胞液：先配备10%的柠檬酸钠溶液，按180mL新鲜鸡血混合100mL10%柠檬酸钠溶液的比例，立即将血液与柠檬酸钠充分混合，同时用玻璃棒搅拌以免凝血。
然后，用离心机以2000转/min的速度离心4min后，用吸管除去离心管上清液，就可获得所需的鸡血细胞悬液。
每组大约需要5—10mL鸡血细胞悬液。
如果无离心机，可将与柠檬酸钠充分混合的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀后，也可获得所需的鸡血细胞悬液。
（四）试剂与仪器：1、2mol/L的NaCl溶液。
称取117g的NaCl，加蒸馏水至1000mL，使之完全溶解，即可获得2mol/L 的NaCl，须按此配方配备大量的2mol/L的NaCl。
2、二苯胺试剂。
A液——1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存。
B液——体积分数为0.2%的乙醛溶液。
实验前，将0.1mL的B液加入到10mL的A液中，现配现用。
3、0.015mol/L的NaCl溶液。
桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展桑叶中1—脱氧野尻霉素（1-DNJ）是一种天然生物碱，具有多种生物活性，包括抗糖尿病、抗肿瘤、抗病毒等作用。
由于其在医药和保健品领域的广泛应用前景，目前对于桑叶中1—脱氧野尻霉素的提取纯化及检测方法研究进展已经引起了人们的广泛关注。
一、提取纯化方法1. 溶剂提取法溶剂提取法是目前较为常用的提取1-DNJ的方法之一。
其原理是利用有机溶剂与桑叶中的1-DNJ发生相互作用，从而将1-DNJ分离出来。
常用溶剂包括乙醇、甲醇等，提取时需要考虑溶剂与1-DNJ的相容性及溶剂挥发性等因素。
2. 超声波辅助提取法超声波辅助提取法是利用超声波在液体中产生空化现象，加速溶剂对样品的渗透和溶解，从而提高提取效率的一种方法。
其优点是操作简单，提取效率高，适用于大批量桑叶中1-DNJ的提取。
3. 分离纯化方法分离纯化方法主要包括凝胶过滤、离子交换、凝胶层析、反相高效液相色谱等。
这些方法可以将提取得到的1-DNJ进一步纯化，得到高纯度的1-DNJ。
二、检测方法1. 高效液相色谱法高效液相色谱法是目前检测1-DNJ的主要方法之一。
该方法通过在高效液相色谱仪上使用适当的色谱柱和检测条件，可以快速、准确地分离和检测1-DNJ。
该方法还可以实现对1-DNJ的定量分析。
2. 薄层色谱法薄层色谱法是另一种常用的检测1-DNJ的方法。
该方法通过在薄层色谱板上将样品进行分离，然后利用显色剂进行显色，从而可以观察到1-DNJ的条带，并进行半定量或定性分析。
3. 质谱法质谱法是一种快速、高灵敏度的检测方法，可以对1-DNJ进行精确的定性和定量分析。
主要包括质子化电喷雾质谱（ESI-MS）和电喷雾离子化质谱（ESI-MS）等。
三、研究进展目前，关于桑叶中1—脱氧野尻霉素的提取纯化及检测方法研究已经取得了一定进展，但仍存在一些问题需要解决。
提取纯化方法在提取效率和纯度方面还有待进一步提高；检测方法需要更加灵敏、准确和快速；还需要不断深入研究1-DNJ在医药和保健品领域的应用前景，促进其产业化生产和应用。
DNJ的提取与分离与测定
1、仪器和试剂
1.1仪器
1000ml烧杯，离心管，水浴锅，超声波处理器，旋转蒸发仪，离心机，阳离子交换树脂，真空干燥器，一次性针头过滤器，HPLC。
1.2 试剂
65%乙醇1500ml,0.25%氨水洗脱液，正丁醇，蒸馏水，硼酸盐缓冲液(pH8.5)，5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液，0.1%(V/V)的醋酸水溶液，0.1mol/L 的甘氨酸
2、步骤
2.1 DNJ的提取与分离
粉粹桑叶——取100g样品于1000ml的烧杯中——加65%乙醇800ml，浸泡30min——超声处理20min——过滤，收集滤液——残渣加65%乙醇400ml，反复处理一次——合并滤液——回收乙醇浓缩到最小体积——离心分离——取上清液，装入阳离子交换树脂——蒸馏水冲洗至流出液体为无色为止——0.25mol/L氨水洗脱（1-2ml/min）收集洗脱液——浓缩洗脱液——用浓缩液1倍体积的正丁醇萃取3次——去水相，合并正丁醇相——回收正丁醇——真空干燥——成品
成品中DNJ含量的测定
2.2 DNJ含量的测定
成品——加蒸馏水定容至50ml——取4ml水溶液离心——去上清液
10ul于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加
20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应
20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取1 0μl 进样分析。
2.3 DNJ标准溶液的制备
3.4mg DNJ 标准品定容于100ml 蒸馏水中——用蒸馏水稀释成
0.567、1.133、2.266、3.399、5.67、11.33、34μg/ml 的标准溶液系列——分别取10ul标液于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加
950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取1 0μl 进样分析。
2.4 空白溶液的制备
去上清液10ul于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取10μl 进样分析。
