多糖的提取、分离与纯化

多糖提取提取工艺
糖提取工艺主要分为细胞壁破碎、酶解、凝固、分离、纯化等步骤。

1、细胞壁破破：细胞壁破碎是糖提取工艺中的第一步，主要是利用
机械方法，如研磨、搅拌等方式，对细胞壁或是植物细胞进行破坏，使其
内含的糖分被释放出来。

2、酶解：酶解是糖提取工艺中的第二步，主要是利用植物内含酶作用，将细胞糖解为葡萄糖或果糖。

3、凝固：凝固是糖提取工艺中的第三步，通过加热蒸馏，使水分蒸发，提取的糖浓缩，形成糖液浆，去除有害物质。

4、分离：分离是糖提取工艺中的第四步，主要是通过沉淀、浓缩、
萃取、膏化等方法，将有用糖组分从糖液浆中提取出来，去除杂质。

5、纯化：纯化是糖提取工艺中的最后一步，通过适当的方式，使糖
组分更加纯净，除去微量的杂质。

一、实验目的1. 掌握多糖纯化的基本原理和方法。

2. 学习并运用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。

3. 通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。

二、实验原理多糖是一类重要的生物大分子，具有广泛的生物活性。

然而，天然多糖往往伴随着一些蛋白质、脂肪和色素等杂质，这些杂质会干扰多糖的结构鉴定和活性分析。

因此，对多糖进行纯化是研究多糖生物活性的关键步骤。

多糖的纯化主要包括以下步骤：1. 提取：采用热水浸提法或超声波辅助提取法等从植物、动物或微生物中提取多糖。

2. 净化：去除提取液中的蛋白质、脂肪和色素等杂质。

3. 纯化：利用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。

4. 测定：通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。

三、实验材料1. 实验药品：DEAE-Sephadex A-50柱层析材料、氨水、盐酸、无水乙醇、葡萄糖标准品等。

2. 实验仪器：层析柱、紫外可见分光光度计、离心机、移液器、容量瓶等。

四、实验方法1. 提取：称取一定量的多糖样品，加入适量蒸馏水，用超声波辅助提取法提取多糖。

提取液离心分离，取上清液作为待纯化样品。

2. 净化：将待纯化样品加入适量的氨水，调节pH值至7.0，静置一段时间。

离心分离，取上清液作为待纯化样品。

3. 纯化：将DEAE-Sephadex A-50柱层析材料预处理后，装入层析柱。

将待纯化样品上柱，用蒸馏水进行梯度洗脱。

收集洗脱液，利用紫外可见分光光度计检测洗脱液中的多糖含量。

4. 测定：配制葡萄糖标准溶液，绘制标准曲线。

将纯化后的多糖样品按照比色法进行测定，计算纯化前后多糖的浓度。

五、实验结果1. 提取：超声波辅助提取法提取多糖，提取率约为70%。

2. 净化：氨水处理去除蛋白质、脂肪和色素等杂质，纯化率约为90%。

3. 纯化：DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化，纯化率约为95%。

4. 测定：纯化前后多糖浓度分别为1.5 mg/mL和0.7 mg/mL，纯化效果良好。

多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。

首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。

其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。

水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。

稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。

稀碱法适合于提取碱溶性糖。

然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。

第四步是沉淀多糖。

大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。

常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。

最后是除去蛋白质。

除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。

得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。

多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。

纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。

此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。

(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。

纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。

因此，测得的分子量一般为平均分子量。

过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。

目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。

1.2.1发酵、提取取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。

多糖的提取和纯化Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT多糖的提取和纯化→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥首先除去表面脂肪。

原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。

温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。

得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。

也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。

然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。

然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。

将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。

干燥后可得粉末状的粗多糖。

微波辅助提取法：其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。

由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。

而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清[15]。

聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（％）。

超声辅助法：其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。

多糖分离纯化1. 概述多糖是由许多重复单元组成的生物大分子，具有广泛的生物功能和应用价值。

多糖的分离纯化是从混合物中分离出目标多糖并提高纯度的过程。

本文将介绍多糖分离纯化的常用方法和技术，以及其在食品、药品和生物工程等领域的应用。

2. 多糖的分离方法多糖的分离方法主要包括溶剂沉淀、离子交换、凝胶过滤、超滤、逆流层析、电泳和气相色谱等。

下面将分别介绍这些方法的原理和应用情况。

2.1 溶剂沉淀溶剂沉淀是利用溶剂的物理性质，如极性和温度等，使多糖在溶液中发生相分离的方法。

通常采用醇类溶剂，如乙醇或异丙醇。

溶剂沉淀适用于多糖与其他溶质的溶解度差异较大的情况，但纯度较低。

2.2 离子交换离子交换是利用离子交换树脂上的功能基团与多糖分子间发生离子交换反应的方法。

树脂的功能基团可以选择性吸附或释放多糖分子。

离子交换适用于多糖的分子量差异较大的情况，例如海藻酸和壳聚糖的分离。

2.3 凝胶过滤凝胶过滤是利用凝胶的孔隙结构将分子按大小分离的方法。

多糖分子较大，可以被凝胶孔隙排除，而小分子可以通过凝胶透过。

凝胶过滤常用于多糖与其他小分子的分离，如蛋白质和核酸。

2.4 超滤超滤是利用超滤膜的孔隙结构将溶液分离的方法。

超滤膜的孔径可以根据需要选择，通常是分子量截留范围在1 kDa至100 kDa之间。

超滤适用于多糖与其他大分子的分离，如蛋白质和核酸。

2.5 逆流层析逆流层析是利用多糖与填料间的亲和作用进行分离的方法。

填料可以是具有特定亲和性的配体，如亲和树脂。

逆流层析适用于分子间相互作用较强的多糖分离。

2.6 电泳电泳是利用电场作用将分子按电荷和大小进行分离的方法。

多糖可根据电荷差异选择合适的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳。

电泳在多糖的分子量分析和负载量测定中广泛应用。

2.7 气相色谱气相色谱是利用样品在气相载体中的分配和迁移以实现分离的方法。

多糖需要经过甲硅烷衍生化处理后才可以进行气相色谱分析。

气相色谱适用于多糖的含量测定和结构分析。

1、多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。

多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位,决定在提取之前就是否做预处理。

动物多糖与微生物多糖多有脂质包围,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂,释放多糖。

植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类,在提取前,应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理,目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。

1.1溶剂法1.1.1水提醇沉法水提醇沉法就是提取多糖最常用的一种方法。

多糖就是极性大分子化合物,提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。

用水作溶剂来提取多糖时,可以用热水浸煮提取,也可以用冷水浸提渗滤,然后将提取液浓缩后,在浓缩液中加乙醇,使其最终体积分数达到70 %左右,利用多糖不溶于乙醇的性质,使多糖从提取液中沉淀出来,室温静置 5 h,多糖的质量分数与得率均较高。

影响多糖提取率的因素有:水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备,生产工艺成本低,安全,适合工业化大生产,就是一种可取的提取方法。

但由于水的极性大,容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来,从而使提取液存放时腐败变质,为后续的分离带来困难,且该法提取比较耗时,提取率也不高。

1.1.2酸提法为了提高多糖的提取率,在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。

如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解,可用乙酸或盐酸使提取液成酸性,再加乙醇使多糖沉淀析出,也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。

由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出,稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高,但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂,且酸会对容器造成腐蚀,除弱酸外,一般不宜采用。

因此酸提法也存在一定的不足之处。

1.1.3碱提法多糖在碱性溶液中稳定, 碱有利于酸性多糖的浸出,可提高多糖的收率,缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质,使粘度过大,过滤困难,且浸提液有较浓的碱味,溶液颜色呈黄色,这样会影响成品的风味与色泽。

多糖的提取分离纯化及分析鉴定方法研究多糖是由多个单糖分子通过糖苷键连接而成的高分子化合物。

多糖具有广泛的应用价值，包括食品、医药、化妆品和生物材料等领域。

因此，对多糖的提取、分离纯化以及分析鉴定方法的研究具有重要意义。

一、多糖的提取方法1.物理法物理法主要包括热水提取法、酸碱提取法和微波提取法等。

热水提取法是最常用的提取方法之一，通过加热使细胞壁破烂，有利于多糖的溶出。

酸碱提取法则是利用酸碱反应将多糖从细胞壁中释放出来。

微波提取法则是利用微波辐射对样品进行加热，加速多糖的溶解和释放。

2.化学法化学法主要包括酶解法、酶解分离法和酸碱水解法等。

酶解法是利用特定的酶对样品进行处理，将多糖分解为单糖，然后进行分离和纯化。

酸碱水解法则是通过酸碱反应将多糖水解为低聚糖和单糖。

3.生物法生物法是利用微生物或植物产生的酶对多糖进行酶解和分离。

生物法具有选择性强、工艺简单等优点，在多糖提取中得到了广泛的应用。

二、多糖的分离纯化方法多糖的分离纯化方法主要包括离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法和亲和色谱法等。

1.离子交换色谱法离子交换色谱法是利用离子交换树脂对多糖进行分离的方法。

通过控制溶液pH值和离子强度等条件，使不同电荷的多糖在树脂上发生吸附反应，实现多糖的分离纯化。

2.凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法是根据多糖分子量的大小来进行分离的方法。

多糖分子量越大，越容易在凝胶渗透色谱柱的孔隙中滞留，分离得到纯度较高的多糖。

3.亲和色谱法亲和色谱法是利用多糖与一些特定配体之间的相互作用进行分离的方法。

例如，可以利用亲和色谱柱上的特定配体与多糖的特定结构之间的结合作用，实现多糖的分离和纯化。

三、多糖的分析鉴定方法多糖的分析鉴定方法主要包括红外光谱法、紫外光谱法、核磁共振波谱法、高效液相色谱法和气相色谱法等。

1.红外光谱法红外光谱法能够通过检测样品吸收、散射或透射特定波长的红外光来分析多糖的结构和功能。

2.紫外光谱法紫外光谱法是利用多糖分子在紫外可见光区域的吸收特性进行分析。

多糖的分离纯化及分析一、多糖的提取方法（一）溶剂提取法1、水提法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法.多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂.用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高.2、酸碱提法有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。

有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。

与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。

3、超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术.（二）生物酶提取法酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。

此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。

（三）超声提取法超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。

超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。

（四）微波提取微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。

二、多糖的分离纯化（一）多糖的分离采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分级的方法可达到纯化的目的．可按溶解性不同进行分级、按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级．1、按溶解性不同分离（1）分步沉淀法分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀．（2）盐析法盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。

食品科技植物及食用菌多糖的提取、分离纯化及结构分析白海娜（吉林化工学院生物与食品工程学院，吉林吉林 132022）摘 要：多糖是广泛存在于动植物、微生物中的一类大分子化合物，具有调节免疫力、抗癌、抗氧化、抗衰老等方面的功能作用，本文主要对植物及食用菌多糖的提取、分离纯化及结构分析进行阐述。

关键词：多糖；提取；分离纯化；结构分析多糖又称聚糖，是由分子质量从中等到高分子的聚合物，不同聚糖中单糖的同一性、链的长度、连接单糖的键类型以及链的分支程度等方面不同。

植物及食用菌多糖的结构特征以及生物活性等研究已成为食品和制药的热门研究。

与蛋白质的研究相比，多糖各方面研究还比较落后。

本文主要对植物及食用菌多糖的提取、分离纯化及结构分析进行阐述。

1 多糖的提取1.1 酶解提取该方法是由于酶具有专一性的特征，所以根据酶解反应将植物细胞壁分解成小分子物质，该小分子物质容易溶于提取溶剂，使植物细胞壁被破坏，从而使植物细胞中的有效成分溶出。

此方法的优点是不仅能使植物细胞壁中的有效成分发生降解，使其更容易被提取出来，从而达到使提取率提高或溶剂用量减少的目的；而且还可以对植物药中的部分杂质进行选择性降解，使多糖的提取分离更加容易，同时除了所需的有效成分之外其他的成分还可以收集利用[1]。

尽管该方法在多糖的提取率方面得到了提高，但是在操作过程中温度和pH的变化会严重影响所用酶的活性，且提取的成本相对较高。

1.2 微波提取微波提取多糖的方法又被称为微波萃取技术，该方法是通过微波辐射，使高频电磁波快速穿透被萃取的物质。

因为植物细胞在微波辐射能的作用下吸收了微波能，使植物细胞的内部温度升高，从而导致了组织内部的压力变大，细胞发生破裂，需要被提取的成分在能量的作用下从内部溶出。

该方法在提取多糖时的优势是操作简单、溶剂的使用量消耗少、在操作过程中不会造成污染、多糖提取率高等。

1.3 热回流提取法该方法是在多糖提取方法中最为传统、也是一种操作简单的方法，此方法是根据相似相溶的原理来提取多糖，提取溶剂一般是选择用热水、酸、碱；但是该方法由于在提取过程中温度高、时间长、能量消耗高，容易引起多糖结构以及生物活性发生变化，因此若利用此方法提取多糖，会限制天然多糖产业在市场上的发展。

多糖的提取原理
多糖的提取原理是将植物或微生物中的多糖分子，经过一系列的物理、化学方法进行分离和纯化。

首先，利用机械方法（如研磨、切割等）破碎植物细胞壁或微生物细胞膜，释放出多糖分子。

然后，可以通过浸提、溶解、离心等方法将多糖与其他组分分离。

接下来，可以利用不同特性的分离方法进一步提取纯化多糖。

常见的方法包括酸碱水解、醇沉、离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶电泳等。

其中，酸碱水解可以利用多糖在酸性或碱性条件下的溶解性差异进行分离。

醇沉可以根据多糖与醇溶液的亲和性差异实现分离。

离子交换层析则是利用多糖在具有固定电荷的树脂上吸附和洗脱的原理进行纯化。

凝胶过滤层析和凝胶电泳可以根据多糖的分子大小和电荷来分离。

最后，对提取得到的多糖进行浓缩和干燥，得到纯化的多糖样品。

此外，还可以利用光谱分析、色谱分析等方法对提取得到的多糖进行结构表征和定量分析。

总之，多糖的提取原理是依靠一系列的物理、化学方法对植物或微生物中的多糖进行分离和纯化，最终得到纯化的多糖样品。

一、实验目的1. 掌握多糖提取分离的基本原理和方法。

2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能。

3. 通过实验，了解不同多糖的提取分离效果。

二、实验原理多糖是一类天然高分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中。

多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等。

本实验采用水提醇沉法提取分离多糖，利用多糖在水中的溶解度与醇溶液中的溶解度差异，实现多糖的分离纯化。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：香菇粉末、蒸馏水、95%乙醇、NaOH、HCl、无水硫酸钠、苯酚、硫酸等。

2. 实验仪器：电热恒温水浴锅、电子天平、离心机、超声波清洗器、旋转蒸发仪、层析缸、薄层层析板、显色剂等。

四、实验步骤1. 香菇多糖提取（1）称取4g香菇粉末，加入200mL蒸馏水，加热至80℃，保持2h。

（2）冷却至室温，加入适量的95%乙醇，静置过夜。

（3）离心分离，取上清液。

（4）将上清液加入适量的无水硫酸钠，静置过夜。

（5）离心分离，取沉淀。

2. 香菇多糖分离纯化（1）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，加入适量的NaOH溶液，调节pH至7.0。

（2）加入适量的HCl溶液，调节pH至4.5。

（3）静置过夜，离心分离，取沉淀。

（4）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，加入适量的95%乙醇，静置过夜。

（5）离心分离，取沉淀。

（6）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，加入适量的苯酚，显色后进行薄层层析。

3. 香菇多糖鉴定（1）根据薄层层析结果，鉴定香菇多糖的纯度。

（2）根据苯酚-硫酸法测定香菇多糖的浓度。

五、实验结果与分析1. 香菇多糖提取实验中，香菇多糖的提取率为8.50%，表明水提醇沉法能够有效提取香菇中的多糖。

2. 香菇多糖分离纯化通过调节pH和醇沉，成功分离纯化了香菇多糖，纯度达到90%以上。

3. 香菇多糖鉴定根据薄层层析结果，香菇多糖主要成分为β-葡聚糖。

苯酚-硫酸法测定香菇多糖的浓度为1.20mg/mL。

六、实验结论1. 本实验采用水提醇沉法成功提取分离了香菇多糖，提取率为8.50%，纯度达到90%以上。

香菇多糖的提取、纯化（水提醇沉法）一、实验目的了解并掌握水提醇沉法提取香菇多糖的原理和方法。

二、实验原理提取香菇多糖的方法有：水提醇沉法（热水浸提法）、碱浸提法和酶解法。

水提醇沉法是最常见的方法。

香菇多糖溶于水。

热水浸提时，香菇的组织细胞破裂，多糖成分浸出，再用乙醇沉淀香菇多糖。

料液比、温度、时间、PH值、乙醇浓度、提取次数都是影响提取效果的重要因素。

最佳提取条件为：料液比1:40（30~40倍均可），提取温度为80~95℃，提取时间2h，提取时的乙醇浓度为75%，PH值6.0~8.0，提取次数为2次。

三、材料和仪器材料：香菇（取子实体）、蒸馏水、无水乙醇、Sevage试剂、（Sevage试剂配制：取三氯甲烷和正丁醇，按照5﹕1进行混合，放置在棕色瓶中备用。

）仪器：分析天平、高速离心机、离心试管、冷冻干燥机、磁力搅拌器、恒温水浴锅、烧杯等。

四、实验步骤1、提取：将干燥的香菇子实体粉碎后，加入30倍的蒸馏水，用沸水提取2h，过滤，滤渣再按第一次提取工艺提取1次，将上清液合并后于80℃下浓缩。

在冷却后的浓缩液中加入一定量95%的乙醇，使乙醇的浓度为75%，室温下放置过夜，离心，将收集到的沉淀用真空冷冻干燥机冻干，放到后4℃冰箱中保存、备用。

2、sevage法除蛋白：称取得到的样品10g（含水率9.7%）充分溶解于100mL蒸馏水中。

加入一定体积的Sevage试剂，用磁力搅拌器剧烈搅拌20 min 左右，离心，分离粗多糖中蛋白质杂质。

重复2次。

3、乙醇沉淀：往除过蛋白的多糖溶液（上清液）中缓慢加入95%的乙醇，至乙醇体积占溶液总体积的75%，边加边搅拌，使多糖均匀沉淀。

放在4℃冰箱中6h，6000r/min 离心10min，弃去上清液，将沉淀在溶解于蒸馏水中，重复以上过程3次，将最后得到的溶液放在-40℃的冷冻干燥机中冻干，制得香菇粗多糖。

五、含量测定（苯酚-硫酸法）1、标准曲线的绘制精确称取100 mg 葡萄糖，溶解定容于100 mL容量瓶中，得含1 mg/mL葡萄糖的对照品储备溶液，备用。

一、实验目的1. 学习和掌握竹叶多糖的提取、分离和纯化方法。

2. 探究不同提取工艺对竹叶多糖提取率的影响。

3. 了解竹叶多糖的理化性质及生物活性。

二、实验原理竹叶多糖是一种天然高分子化合物，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、降血糖等。

本实验采用水提法提取竹叶多糖，通过加热、搅拌等手段使多糖从竹叶中溶解出来，再通过离心、沉淀等步骤进行分离和纯化。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 毛竹叶：取自当地竹林，新鲜、干燥。

- 无水乙醇、苯酚、硫酸、NaOH等化学试剂。

- 葡聚糖凝胶、纤维素柱等分离纯化材料。

2. 实验仪器：- 电子天平、电热恒温水浴锅、高速离心机、超声波清洗器、电热恒温干燥箱、紫外可见分光光度计等。

四、实验方法1. 竹叶多糖提取：（1）将干燥的毛竹叶粉碎成粉末，过筛，备用。

（2）称取一定量的竹叶粉末，加入适量的蒸馏水，在80℃下加热提取90min。

（3）提取液冷却后，以3000r/min的速度离心10min，取上清液。

（4）将上清液加入无水乙醇，使多糖沉淀，沉淀物用蒸馏水洗涤3次。

（5）将沉淀物干燥，得到竹叶多糖粗品。

2. 竹叶多糖分离纯化：（1）将得到的竹叶多糖粗品用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化。

（2）收集各洗脱组分，用苯酚-硫酸法测定各组分中多糖含量。

（3）将含量较高的组分进一步用纤维素柱进行分离纯化。

3. 竹叶多糖理化性质及生物活性测定：（1）采用薄层色谱法分析竹叶多糖的单糖组成。

（2）采用气相色谱法分析竹叶多糖的分子量分布。

（3）采用MTT法检测竹叶多糖的抗肿瘤活性。

（4）采用DPPH法检测竹叶多糖的抗氧化活性。

五、实验结果与分析1. 竹叶多糖提取率：本实验采用水提法提取竹叶多糖，提取率为5.2%。

2. 竹叶多糖分离纯化：通过葡聚糖凝胶柱和纤维素柱分离纯化，得到纯度较高的竹叶多糖。

3. 竹叶多糖理化性质及生物活性：（1）薄层色谱法分析结果显示，竹叶多糖主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖等单糖组成。

多糖的提取、分离纯化真菌多糖是从真菌细胞壁和组织体的菌丝之中分离出的由十个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物。

真菌多糖能通过对淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统而调节机体的免疫功能，在治疗肿瘤、心血管、肝炎、糖尿病，甚至爱滋病等方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用[1]。

真菌多糖作为药物毒性极小，其在治疗代谢紊乱、感染及癌症等疾病方面的应用正不断增加，它在医疗上是一种很好的佐料。

真菌多糖其研究日益受到人们重视。

1 真菌多糖的提取、分离纯化与纯度检测1.1 真菌多糖的提取和分离提取真菌多糖的原料，应先用丙酮、乙醚或乙醇进行预处理，以除去原料中的脂类物质,然后用热水、稀酸或稀碱反复提取，提取液中和至中性后，用甲醇或乙醇沉淀，沉淀物经离心、干燥后，制得粗多糖。

1.1.1 粗多糖中蛋白的去除常用的脱蛋白的方法主要有3种：Sevag法是用氯仿、正丁醇或正戊醇按5:1混合后,加到样品水溶液中振摇，离心除去凝胶状蛋白质，反复多次直至蛋白质除尽为止。

三氟三氯乙烷法[2]是多糖溶液和三氟三氯乙烷1:1混合,在低温下搅拌10min左右,离心得上层溶液, 上层溶液继续用上述方法处理几次,即得无蛋白的多糖溶液。

三氯乙酸法是在多糖水溶液中滴加3%的三氯乙酸，直至溶液不再浑浊为止，于5～10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白的的多糖溶液，但是此法会引起多糖的降解，不宜采用。

另外还有硫酸铵法和蛋白酶法。

1.1.2脱色多糖中所含的色素一般有两种，即游离色素和结合色素。

游离色素大多呈阴离子状态，可以通过离子交换法除去，常用DEAE纤维素或DEAE-Sepharose TM Fast Flow来吸附色素。

若多糖与色素结合，则色素易被离子交换柱吸附，不易被水洗脱，这类色素可采用氧化脱色：以浓氨水（或NaOH溶液）调至ph8.0左右，于50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2h；根据真菌多糖与色素的结合情况选择合适的脱色方法[3]。