酶的提取与分离纯化优秀课件
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第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸有机聚合物沉淀
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
酶的提取与分离纯化
.
2
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
.
3
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均 质打破细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。
.
14
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
.
5
表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法
机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法
压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法
反复冻融法
干燥法
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
.
6
化学破碎法
添加有机溶剂、 通过各种化学试剂对细胞膜 添加表面活性剂 的作用，而使细胞破碎
.
22
2、表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
酶的提取与分离纯化ppt课件
整理版课件
22
4.干燥法
气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥
使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、 丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被 抽提出来。
气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
整理版课件
23
三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
整理版课件
19
5.其他方法
1. X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa 以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破 碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起 的。
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及 活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。
整理版课件
21
3. 反复冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键 结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变 化，引起细胞膨胀而破裂。
适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融 过程中可能引起某些蛋白质变性。
整理版课件
18
化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
整理版课件
16
（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结 构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持， 一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落， 使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补， 从而导致内层膜通透性的增强。
酶的提取与分离纯化课件
18
提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
19
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
20
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
酶的提取与分离纯化
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
2
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
9
细菌细胞壁的结构
10
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
6
(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
7
二、细胞破碎（胞内酶）
酶的提取与分离纯化幻灯片PPT
硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇
羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素
聚乙二醇（PEG） 磷酸钾、硫酸铵
硫酸钠、硫酸镁
②萃取原理： 利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。
③应用 胞内酶的提取和精制: 除去细胞碎片，并使酶得到纯化。
几种典型的双水相萃取酶蛋白实例
酶
菌种
相系统
延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐
天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐
-半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐 亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dex
乙醇脱氢酶 Baker’s yeast PEG/ 盐
青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐
双水相萃取法的重要研究方向
--亲和萃取（亲和分配 ） 使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分
解或溶解度小的物质分开。 降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶
解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。
●常用超临界液态CO2作为萃取剂，因为： 液体CO2无毒 临界温度（304.06K）接近常温 临界压力（7.38MPa）较低 操作安全
超临界CO2萃取技术在生物、食品等工业中的应用
CO2萃取部分产品
V=V0—S—12--—SS12—
V,V0 :分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度
★
⑵添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的
盐浓度又Байду номын сангаас高时。
按下式计算，得表中数据
W=
B(S2-S1) —1-—AS—2 ———
A,B——常数，与温度有关。
酶的分离纯化 (2)优秀课件
酶的分离纯化 (2)优秀课件
1
Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
2
第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
----
8
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
17
3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
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Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
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第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
----
8
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
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3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
课件十二酶的提纯和分离纯化的方法(一).
工作任务（二）酶的分离纯化方法
过滤与膜分离
加压膜分离
微滤 超滤 反渗透 电渗析 离子交换膜电渗析 透析
膜分离
电场膜分离
扩散膜分离
工作任务（二）酶的分离纯化方法
过滤与膜分离
根据膜材料和不同进料液的特性，商品应 用的膜产品通常采取如下几种结构形式： 管式；中空纤维；卷式；平板式。
工作任务（二）酶的分离纯化方法
用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
有机溶剂提取
可与水混溶的有机溶剂
工作任务（二） 酶的分离纯化方法
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除去与目的产物性质差异 很大的杂质。使用各种柱层析法。 高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去与产物性质相似的杂 质。可用制备式电泳或HPLC。
工作任务（二）酶的分离纯化方法
沉淀分离
盐 析 沉 淀
调整盐浓度的方式 a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液） 适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度 又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液 b. 添加固体硫酸铵 适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到 的盐浓度又很高时。
工作任务（二）酶的分离纯化方法
过滤与膜分离
原料液
膜 微滤(Microfiltration，MF) 一种静态过滤，随过滤 分 时间延长，膜面上截流沉 离 微 滤
积不溶物，引起水流阻力 增大，透水速率下降，直 至微孔全被堵塞；
渗透液 无流动操作
工作任务（二）酶的分离纯化方法
过滤与膜分离
膜 分 离
超 滤
超滤 (ultrafiltration，UF ) 一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生
酶的分离与纯化课件
酶的分离与纯化课件
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（六）萃取分离(extraction)
概念:P154 1、溶剂萃取法 比沉淀分离程度高,比离子交换法选择性好,
传质速度快,生产周期段,便于连续操作,容易实现自动化. 2、双水相萃取法(Partion of two aqueous phase extraction)
用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液进行萃取. 3、超临界流体萃取法 4、反胶团萃取法
3）凝聚和絮凝 用Al2(SO4)3等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互 碰撞发生凝集。形成的颗粒较细。 絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生 物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成10mm大小 絮凝团的过程。形成的颗粒较粗，用量小，速度快。
4) 吸附法
酶的分离与纯化课件
6
(3)色素及其他物质的去除
业：高速珠磨机
• 高压匀浆法：大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度细
胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的G+菌，含有包含体
（Inclusion body）的基因工程菌不宜用此法。
• 超声波法（Ultrasonication）：杆菌比球菌容易破碎； G-比 G+容易
破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样品温度？？
• 原理：生物物质在双水相体系中的选择性分配。(酶、蛋白质等生物 大分子的分配系数大致在0.1-10之间)。
酶的分离与纯化课件
30
• 各种双水相系统
酶的分离与纯化课件
31
• 双水相系统的应用
酶的分离与纯化课件
32
二、酶的精制
根据原理,酶的纯化方法分为: 1)沉淀法;2)相分配法;3)柱层析法;4)电泳或离心法。
《酶工程》课件-酶的提取与分离纯化
01
02
03
04
低温保存
将酶保存在低温条件下，如冰 箱或冰柜中，以降低酶的活性
损失。
添加稳定剂
在酶溶液中添加稳定剂，如糖 、甘油等，以增加酶的稳定性
。
真空干燥
将酶进行真空干燥处理，制成 干粉或结晶，以便长期保存。
调节pH值
通过调节酶溶液的pH值，可 以稳定酶的构象，降低酶的失
活速率。
实验操作中的安全防护措施
速率，从而计算酶活性。
荧光法
利用荧光物质作为底物，经酶 催化后产生荧光，通过测量荧 光强度变化来检测酶活性。
化学发光法
利用化学发光物质作为底物， 经酶催化后产生发光，通过测 量发光强度变化来检测酶活性 。
放射性同位素标记法
利用放射性同位素标记的底物 ，经酶催化后测量放射性强度
变化来检测酶活性。
酶的保存方法
回收率评估
计算分离纯化过程中酶的回收率，评估实验效率 和经济性。
活性评估
通过测定酶的活性，比较分离纯化前后的变化， 评估分离纯化的效果。
稳定性评估
比较分离纯化前后的酶在不同条件下的稳定性， 评估分离纯化的效果。
03
酶的活性检测与保存
酶活性检测的方法
比色法
通过酶催化特定底物反应产生 有色产物，通过比色测定反应
确保实验操作场所的清 洁和卫生，避免污染。
在操作过程中要轻柔， 避免剧烈搅拌或晃动， 以免酶失活。
注意控制实验温度和 pH值等参数，确保酶 的稳定性和活性。
在分离纯化过程中，要 密切关注实验进程，及 时处理通过电泳、质谱等技术手段检测酶的纯度，确保 达到实验要求。
佩戴防护眼镜和实验服
在进行实验操作时，务必佩戴防护眼 镜和实验服，以防止试剂溅出伤人和 避免污染衣物。
第四章 酶的提取与分离纯化 2010.4.12
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 自溶法 外加酶制剂法
本章 目录
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
第四章
酶的提取与分离纯化
Contents of chapter 4
Go Go
1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取 4、酶的分离方法 5、沉淀分离 6、离心分离
Go Go
Go Go
Contents of chapter 4
Go Go
7、过滤与膜分离 8、层析分离 9、电泳分离 10、萃取分离 11、结晶 12、浓缩与干燥
细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链；
相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强 度。
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其
网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽
键的数量和其交联的程度。
合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序 性。
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行 破碎。
一、 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
三、细胞破碎确认
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化学破碎法取决于化学试剂的类型以及细 胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂对各 种微生物作用的部位和方式有所不同。
常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂
1、有机溶剂
能破坏细胞壁中的类脂。 常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透
过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞 外。
表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法 机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法 反复冻融法 干燥法
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
化学破碎法
添加有机溶剂、 添加表面活性剂
一、机械破碎法
2、研磨法 器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常 用于微生物和植物组织细胞的破碎。
一、机械破碎法
3、匀浆法 器械：匀浆器。 通常用于破碎那些易于 分散、比较柔软、颗粒 细小的组织细胞，细胞 破碎程度较高，其机械 切力对酶的破坏也较少， 但难于在工业生产上应 用。
二、物理破碎法
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的 纯化，使用各种 柱层析法。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步 精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。
第一节 细胞破碎（Cell Disruption ）
细胞破碎：是通过各种方法使细胞外层结构破 坏的技术过程。
高压细胞破碎机
（1）高压冲击法 （2）突然降压法
取决因素： a.压力差 b.压力减低的速度 c.细胞种类和生长期
此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌透压差法
步骤：
高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需 反复多次。
在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、 喷雾干燥和冷冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变 细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对 干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出 来。
2、表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
例如，TritonX-100（特里顿）是一种非离子型清洁 剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶 解磷脂，其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层， 从而使某些胞内物质释放出来。
干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活 性物质变性。
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
三、化学破碎法
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
超声波细胞粉碎机（液晶显示）
3、超声波破碎法
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100～150W；温度 0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细 胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破 碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均 质打破细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。
通过各种化学试剂对细胞膜 的作用，而使细胞破碎
酶促破碎法
自溶法 外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加 酶制剂的催化作用，使细胞 外层结构受到破坏，而达到 细胞破碎
一、机械破碎法
通过机械运动所产生的 剪切力的作用，使细胞破 碎的方法 1、机械捣碎法： 器械：捣碎机。 常用于动物内脏、植物叶 芽等比较脆嫩的组织细胞 破碎，也可用于微生物， 特别是细菌的细胞破碎。
各种物理因素：温度、压力、声波等的作用， 使组织细胞破碎的方法。
多用于微生物细胞的破碎。
1、温度差破碎法
利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使 细胞破碎。
温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎 效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度 下操作，以免酶失活。
此法难以用于工业生产。
2、压力差破碎法
酶的提取与分离纯化优秀课件
酶的提取与分离纯化定义
将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再 与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过 程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、 过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电 泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
超声波破碎法特点：
处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失 少、效果好；
是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物 细胞的破碎。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常 在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却 剂进行冷却。
4、反复冻融法
将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然 冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如 此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞 液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂
1、有机溶剂
能破坏细胞壁中的类脂。 常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透
过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞 外。
表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法 机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法 反复冻融法 干燥法
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
化学破碎法
添加有机溶剂、 添加表面活性剂
一、机械破碎法
2、研磨法 器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常 用于微生物和植物组织细胞的破碎。
一、机械破碎法
3、匀浆法 器械：匀浆器。 通常用于破碎那些易于 分散、比较柔软、颗粒 细小的组织细胞，细胞 破碎程度较高，其机械 切力对酶的破坏也较少， 但难于在工业生产上应 用。
二、物理破碎法
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的 纯化，使用各种 柱层析法。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步 精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。
第一节 细胞破碎（Cell Disruption ）
细胞破碎：是通过各种方法使细胞外层结构破 坏的技术过程。
高压细胞破碎机
（1）高压冲击法 （2）突然降压法
取决因素： a.压力差 b.压力减低的速度 c.细胞种类和生长期
此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌透压差法
步骤：
高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需 反复多次。
在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、 喷雾干燥和冷冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变 细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对 干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出 来。
2、表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
例如，TritonX-100（特里顿）是一种非离子型清洁 剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶 解磷脂，其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层， 从而使某些胞内物质释放出来。
干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活 性物质变性。
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
三、化学破碎法
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
超声波细胞粉碎机（液晶显示）
3、超声波破碎法
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100～150W；温度 0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细 胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破 碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均 质打破细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。
通过各种化学试剂对细胞膜 的作用，而使细胞破碎
酶促破碎法
自溶法 外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加 酶制剂的催化作用，使细胞 外层结构受到破坏，而达到 细胞破碎
一、机械破碎法
通过机械运动所产生的 剪切力的作用，使细胞破 碎的方法 1、机械捣碎法： 器械：捣碎机。 常用于动物内脏、植物叶 芽等比较脆嫩的组织细胞 破碎，也可用于微生物， 特别是细菌的细胞破碎。
各种物理因素：温度、压力、声波等的作用， 使组织细胞破碎的方法。
多用于微生物细胞的破碎。
1、温度差破碎法
利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使 细胞破碎。
温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎 效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度 下操作，以免酶失活。
此法难以用于工业生产。
2、压力差破碎法
酶的提取与分离纯化优秀课件
酶的提取与分离纯化定义
将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再 与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过 程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、 过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电 泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
超声波破碎法特点：
处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失 少、效果好；
是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物 细胞的破碎。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常 在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却 剂进行冷却。
4、反复冻融法
将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然 冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如 此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞 液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。