蛋白质的提取与分离纯化.

分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。

1.前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态（如果做不到呢？比如蛋白以包涵体形式存在），不丢失生物活性。

为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点（为什么呢）的有机溶剂如乙醚等脱脂。

然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。

动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。

植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。

细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。

破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。

组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。

细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。

如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。

2. 粗分级分离：当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。

一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。

这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。

有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。

3.细分级分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。

进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。

蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。

根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。

透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。

透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。

超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。

这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。

它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。

由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。

所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。

当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。

例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。

使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。

常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。

可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。

密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。

蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。

凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。

凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。

一、实验目的1. 掌握蛋白质分离纯化的基本原理和操作方法。

2. 学习不同分离纯化技术的应用。

3. 提高实验操作技能和数据处理能力。

二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和功能。

蛋白质分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。

本实验采用多种分离纯化技术，包括：材料预处理、细胞破碎、离心分离、沉淀分离、膜过滤分离和色谱分离等，实现对蛋白质的分离纯化。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、质粒DNA、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR产物、琼脂糖、电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250等。

2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、玻璃棒、培养箱、无菌操作台等。

四、实验步骤1. 蛋白质提取（1）将大肠杆菌细胞培养至对数生长期。

（2）收集细胞，用玻璃棒搅拌，加入预冷的提取缓冲液，低温条件下进行细胞破碎。

（3）离心分离，取上清液即为蛋白质粗提液。

2. 蛋白质沉淀（1）向蛋白质粗提液中加入一定量的硫酸铵，搅拌溶解。

（2）离心分离，收集沉淀，即为蛋白质沉淀。

3. 蛋白质溶解（1）将蛋白质沉淀溶解于适量的缓冲液中。

（2）调整pH值，使蛋白质处于适宜的溶解状态。

4. 蛋白质分离纯化（1）离子交换色谱：将蛋白质溶液上样至离子交换柱，用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。

（2）凝胶过滤色谱：将蛋白质溶液上样至凝胶过滤柱，用缓冲液进行洗脱，收集目标蛋白峰。

5. 蛋白质鉴定（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质分子量。

（2）考马斯亮蓝R-250染色：观察蛋白质条带，判断蛋白质纯度。

五、实验结果与分析1. 蛋白质提取：通过细胞破碎和离心分离，成功提取出大肠杆菌细胞中的蛋白质。

2. 蛋白质沉淀：硫酸铵沉淀法成功地将蛋白质从粗提液中分离出来。

3. 蛋白质溶解：调整pH值后，蛋白质成功溶解于缓冲液中。

4. 蛋白质分离纯化：离子交换色谱和凝胶过滤色谱成功地将目标蛋白从粗提液中分离出来。

实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。

2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。

实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。

将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。

可根据R f 作为定性依据。

Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。

仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。

将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。

取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。

2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。

3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。

2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。

在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。

、蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。

常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法>生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。

这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。

在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得#选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。

被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。

能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。

此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。

由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

前言蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。

蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。

能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。

可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离：1．分子大小不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。

1．1透析和超滤透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。

透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。

超滤一般用于浓缩和脱色1．2离心分离置换缓冲液许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。

差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。

速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。

蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。

本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。

关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。

对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。

蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。

本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。

1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。

2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。

例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。

有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。

3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。

4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。

1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。

蛋白质分离纯化方法的研究进展一、本文概述蛋白质是生物体内最重要的一类大分子化合物，它们在生物体内发挥着多种关键功能，包括酶催化、信号转导、基因表达调控等。

因此，对蛋白质的研究一直是生物医学领域的热点之一。

蛋白质的分离纯化是蛋白质研究的基础，也是后续蛋白质功能研究、结构解析和药物研发等工作的前提。

随着科技的进步和方法的创新，蛋白质分离纯化技术也在不断发展。

本文旨在综述近年来蛋白质分离纯化方法的研究进展，包括传统的分离纯化方法以及新兴的技术，以期为蛋白质研究领域的同仁提供参考和启示。

我们将首先回顾传统的蛋白质分离纯化方法，如凝胶电泳、色谱分离、超速离心等，这些方法在过去几十年中得到了广泛应用，但其分辨率和效率仍有待提高。

接着，我们将重点介绍近年来新兴的蛋白质分离纯化技术，如亲和层析、离子交换层析、反向液相色谱等，这些技术具有更高的分辨率和更好的纯化效果，为蛋白质研究提供了新的有力工具。

我们还将讨论一些新兴的跨学科技术，如纳米技术、生物信息学等在蛋白质分离纯化中的应用，这些技术为蛋白质分离纯化带来了新的机遇和挑战。

我们将对蛋白质分离纯化方法的发展趋势进行展望，以期为未来蛋白质研究提供指导。

我们相信，随着科技的进步和方法的创新，蛋白质分离纯化技术将会更加完善，为蛋白质研究领域的深入发展奠定坚实基础。

二、传统蛋白质分离纯化方法传统蛋白质分离纯化方法主要依赖于蛋白质的理化性质差异，如溶解度、分子量、电荷、疏水性等。

这些方法虽然历史悠久，但在许多情况下仍然被广泛应用，因为它们通常操作简单、成本较低，并且对于某些特定类型的蛋白质具有良好的分离效果。

盐析法：这是最早使用的蛋白质纯化方法之一。

通过调整溶液中的盐浓度，可以降低蛋白质的溶解度，从而实现蛋白质的沉淀。

这种方法常用于蛋白质的初步分离，但纯度通常不高。

有机溶剂沉淀：某些有机溶剂可以降低溶液的介电常数，从而改变蛋白质表面的电荷分布，导致其溶解度降低。

这种方法常用于去除样品中的杂质。

提取蛋白质的4种方法1.离心法：离心法是一种基于蛋白质的大小和密度差异进行分离的方法。

它是最基本的蛋白质提取方法之一、在这个步骤中，样品通过离心机进行离心，这样会使蛋白质在管底或管顶形成一个沉淀或浮游。

通过离心，可以将细胞碎片、核酸和细胞器分离出来。

2.电泳法：电泳法是一种基于蛋白质的电荷和大小差异进行分离的方法。

电泳法可分为两种类型：SDS-和等电聚焦。

在SDS-中，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳进行分离，根据蛋白质的大小产生不同的迁移速度。

而等电聚焦则是根据蛋白质的等电点（pI）进行分离。

3.柱层析法：柱层析法是一种基于蛋白质的亲和性、大小、电荷或亲水性进行分离的方法。

这种方法通过将样品与一个固相材料（如凝胶或颗粒）进行结合，然后通过流动相沿柱上运动，以分离和纯化蛋白质。

常用的柱层析方法包括气相色谱法、蛋白A/G层析法和亲和层析法。

4.免疫沉淀法：免疫沉淀法是一种利用抗体与蛋白质的特异性结合进行分离和纯化的方法。

在这个步骤中，抗体与特定的目标蛋白质结合，然后使用磁珠或琼脂糖等材料结合抗体，使其沉淀在底部。

通过将样品离心，可以将蛋白质与抗体沉淀分离。

总结蛋白质的提取方法有许多种，每一种都有其优势和适用范围。

离心法可以通过离心把蛋白质从其他细胞碎片和核酸中分离出来。

电泳法可以根据蛋白质的大小和电荷差异进行分离。

柱层析法可以根据蛋白质的亲和性和大小进行分离和纯化。

而免疫沉淀法则依赖于抗体与特定蛋白质的结合能力进行分离。

根据需要和实验室资源的可用性，选择适合的蛋白质提取方法可以确保蛋白质的高质量提取和纯化。