二次回归正交旋转组合设计优化大肥蘑菇液体培养基

香菇液体发酵条件的优化魏雅冬;王广慧;李贺;李艳芳;胡畔【摘要】以大小香菇为试验材料,以发酵液中香菇粗多糖含量为测定指标,通过单因素试验和正交试验,确定该供试菌株液体发酵的最佳条件.结果表明,最佳发酵条件为装液量100 mL,接种量10％,摇床转速120 r/min,发酵时间7d.此条件下发酵液中香菇粗多糖含量可达1.7853 g/100 mL.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2016(044)004【总页数】3页(P506-508)【关键词】香菇;液体发酵;优化;正交试验【作者】魏雅冬;王广慧;李贺;李艳芳;胡畔【作者单位】绥化学院农业与水利工程学院,黑龙江绥化152061;绥化学院农业与水利工程学院,黑龙江绥化152061;绥化学院农业与水利工程学院,黑龙江绥化152061;绥化学院农业与水利工程学院,黑龙江绥化152061;绥化学院农业与水利工程学院,黑龙江绥化152061【正文语种】中文【中图分类】S646.1+2香菇为侧耳科植物香蕈的子实体，是我国主要的食用菌出口产品，其味道鲜美，营养丰富，含有18种氨基酸，药用效果显著[1]。

多项试验结果表明，从香菇子实体提炼出来的香菇多糖对癌症的治疗有一定的效果[2]，被称为“保健食品”。

目前，香菇的大面积栽培采用的仍为固体三级菌种，整个制种周期比较长，而且容易遭受污染。

为此，一些食用菌研究者开始研究使用香菇液体菌种，这样可以使菌种的生产周期变短，投入降低，为食用菌的工厂化生产提供了良好的菌种来源，是食用菌产业发展的必然趋势。

不同产地的香菇菌种液体发酵条件不尽相同，本试验主要通过实验室液体摇瓶发酵条件的初步研究，以找到适合绥化地区目标菌种的优化发酵条件，旨在为下一步小型罐体发酵提供一定的理论依据。

1.1 试验材料大小香菇由绥化学院食用菌研究所提供。

试验在绥化学院农学实验室进行。

1.2 试剂及仪器试剂：玉米粉、蛋白胨、麦麸、琼脂粉、牛肉膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、马铃薯等。

红平菇液体发酵培养基优化孟丽;宋超群;吴宝杰;王丽【摘要】采用液体摇瓶培养法,通过单因素试验和正交试验,以菌丝体生物量为主要指标,对红平菇液体发酵培养基配方进行优化.结果表明:红平菇液体发酵最适宜的培养基配方为葡萄糖20 g/L,酵母粉15 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO4· 7H2O 0.5 g/L.进一步对正交试验结果进行验证表明该配方确实为较优配方.%The liquid fermentation medium of Pleurotus djamor in submerged culture was studied according to the index of mycelium dry weight by single factor experiment and orthogonal experiment.The result showed that the optimum fermentation medium for liquid spawn of Pleurotus djamor was glucose 20 g/L,yeast extract 15 g/L, KH2PO42 g/L,MgSO47H2O 0.5 g/L,and we verify it through experiment.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2018(039)006【总页数】3页(P169-171)【关键词】红平菇;液体培养基;碳源;氮源;优化【作者】孟丽;宋超群;吴宝杰;王丽【作者单位】山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018;山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018;山东省茌平县胡屯镇农业技术推广站,山东聊城252121;山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018【正文语种】中文红平菇（Pleurotus djamor）又名桃红平菇、红侧耳，属真菌门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属[1]。

二次回归正交旋转组合设计优选灵芝孢子粉多糖的提取工艺张梅【摘要】利用单因素实验研究料液比、超声时间、超声温度三个因素对灵芝孢子多糖提取的影响,再运用二次回归正交旋转组合设计对超声波提取灵芝孢子多糖的条件进行优化,建立回归模型方程并确定最佳工艺条件.结果得出,灵芝孢子多糖提取的最佳工艺条件:料液比1∶34,超声时间36 min,超声温度54℃,应用优化的工艺条件进行试验,获得灵芝孢子多糖提取率为11.253％.【期刊名称】《闽江学院学报》【年(卷),期】2017(038)002【总页数】6页(P79-84)【关键词】二次回归正交旋转组合设计;灵芝孢子粉;多糖;提取【作者】张梅【作者单位】闽江学院化学与化学工程系,福建福州350108;福建省绿色功能材料重点实验室,福建福州350108【正文语种】中文【中图分类】S567.31灵芝(Ganoderma Lucidum) 是多孔菌科灵芝属真菌的总称，大量的药理研究与临床实践表明，灵芝具有重要的药理作用[1].而灵芝多糖作为灵芝的主要活性成分之一，具有抑制肿瘤生长，调节免疫系统功能[2]，抗氧化、抗衰老、抗辐射、降血糖、降血脂等多种功效[3-4].灵芝多糖的高效提取和生理活性方面的研究是目前研究的热点.近年来，人们采用超声波技术提取真菌中的活性物质，取得了较好的效果.超声波产生的强烈振动、空化效应、较高的加速度、搅拌作用等，能使有效成分更快释放进入溶剂，这不仅缩短了提取的时间，提高了有效成分的提取率，同时还能防止提取物降解等[5].而二次回归正交旋转组合设计提取多糖，能有效地减少试验次数，解决二次回归预测值方差差异大的问题，同时又有正交性[6].因此，本研究以破碎灵芝孢子粉为原料，测定不同条件对灵芝孢子粉多糖提取率的影响情况，通过单因素和二次回归正交旋转组合设计实验，用DPS分析软件拟合多元线性回归方程，以探寻灵芝孢子粉多糖提取的优化条件，旨在为开辟灵芝孢子粉多糖综合提取工艺提供理论参考.1.1 材料与仪器材料：选用经超微粉碎，破壁率≥99%的灵芝孢子粉为试验原材料.葡萄糖、苯酚、浓硫酸、碳酸氢钠等均为分析纯.仪器：722-E型紫外可见分光光度计、BS124S 型电子分析天平、KQ-250B 型超声波仪、TDL80-2B 型台式离心机、智能数显恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱.1.2 标准曲线的测定1.2.1 标准溶液的制备精密称取在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品 1.000 5 g，转移到 100 mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容，即得到浓度为10 mg/mL的标准液，放置备用[7].1.2.2 标准曲线的绘制精密吸取葡萄糖标准溶液0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5 mL按顺序放置于25 mL容量瓶中，依次添加蒸馏水定容，摇匀放置.各取上述溶液5.0 mL放入标有1～8的具塞试管中，分别加入 1.0 mL的苯酚溶液，混匀，迅速取 5.0 mL的浓硫酸加入其中，摇匀，静置30 min，于490 nm处测定吸光度.以灵芝孢子粉多糖浓度(C)为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程： A=0.657C-0.0562，R2=0.9953，多糖含量在0.04～1.00 g/mL的浓度范围内与吸光度有良好的线性关系.1.3 灵芝孢子粉多糖含量的测定称取0.2 g灵芝孢子粉置于离心管中，加入一定量的的蒸馏水，旋好盖子.将离心试管放入超声波仪，调整水浴温度，超声一定的时间后，放入离心机离心20 min.移取上清液到烧杯中，加5 mL的石油醚溶液搅拌，除脂，静置5 min.准确移取烧杯下层液2.5 mL放进具塞试管，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，震荡摇匀后立即加浓硫酸5 mL，摇匀，静置30 min，于490 nm 处测定吸光度值.由葡萄糖标准曲线的回归方程计算出灵芝孢子粉多糖的含量[8-9].1.4 单因素试验按料液比、超声时间、超声温度三种因素进行单因素筛选试验，考察其对灵芝孢子粉多糖提取率的影响.1.5 二次回归正交旋转组合试验设计在单因素试验的基础上，运用DPS分析软件对料液比、超声时间和超声温度3个因素进行二次回归正交旋转组合设计[10-11]，根据各条件进行实验.实验因素和编码水平见表1.2.1 单因素试验2.1.1 料液比对灵芝孢子粉多糖提取率的影响从图1可以看出，在料液比为1∶10～1∶40的范围内，随着料液比的增加，灵芝孢子粉能够很好地溶解在溶液中，使得多糖的提取率快速增长，这可能是因为在这个范围内，溶剂量增加，料液混合充分，更有利于多糖的提取.当料液比达到1∶40时，灵芝孢子粉多糖提取率达到最大值，随后，随着料液比的增加，提取率反而有所下降，即当料液比达到一定程度时，如增大溶剂，反而稀释了有效成分，从而降低了有效成分的比例.因此，本试验初步确定提取的料液比为1∶40.2.1.2 超声时间对灵芝孢子粉多糖提取率的影响由图2表明，在一定范围内，随着超声提取时间的延长，灵芝孢子粉叶多糖的提取率也随之增加，即增加提取时间有利于多糖的提取.提取时间达到 30 min时，多糖提取率达到最大值 10.24%.而后随着时间的延长，提取率反而呈下降趋势，可能是由于超声作用增强对多糖分子的破坏，降低了多糖的提取率.因此，本试验初步确定超声提取时间为 30 min.2.1.3 超声温度对灵芝孢子粉多糖提取率的影响由图3可见，在30～60 ℃范围内，超声温度的作用效果显著，随着超声温度的提高，微波对细胞灵芝孢子粉多糖提取率也快速增长.在温度达到60 ℃时，多糖提取率为9.84%，达到了最佳效果.随着温度继续升高，高温可能破坏了多糖的结构，使多糖发生降解，灵芝多糖提取率有所下降.因此，本试验初步确定提取温度为60 ℃.2.2 二次回归正交旋转组合试验设计根据单因素实验结果，运用DPS统计分析软件进行三因子二次回归正交旋转组合设计试验，具体实验方案及实验结果见表2.根据表2建立灵芝孢子粉多糖提取率与料液比X1、超声时间X2、超声温度X3三因子的数学回归模型为：Y=-55.798 89+0.735 52X1+0.969 90X2+1.227 42X3-0.009 81X12-0.011 24X22-0.010 56X32-0.002 53X1X2+0.001 69X1X3-0.001 84X2X3.由表3可知，回归方程的失拟性检验F1=9.003 9>F0.05(5,8)=3.69，表明回归方程对实际试验拟合较好，但模型可能受到其他因子的影响，如灵芝孢子粉粒的大小等.回归方程显著性检验F2=75.262 6>F0.01(9,13)=2.71，回归显著，即试验所选择的3个因素对灵芝孢子粉多糖提取率有显著性影响，由此说明得到的二次回归方程模型的预测值与实际值相吻合.回归方程在a=0.01显著水平时，剔除了不显著项后，得到简化后的回归方程为：Y=-55.798 89 +0.735 52X1 +0.96990X2+1.227 42X3-0.009 81X12-0.011 24X22-0.010 56X32-0.002 53X1X2.F值可以反映各因素对试验指标的重要性，F值越大，表明该因素越能影响实验结果.从方差分析结果可知，3个因素对灵芝孢子粉多糖提取率的影响强弱顺序为：超声温度>超声时间>料液比.由实验分析得到灵芝孢子粉多糖提取的最优条件方案：料液比1∶34，超声时间36 min，超声温度54 ℃.以此最优工艺条件进行3次验证实验，测得提取率为11.253%.在单因素试验的基础上，用二次回归正交旋转组合设计对超声波提取灵芝孢子多糖的条件进行优化，得到提取灵芝孢子多糖工艺条件优化的回归数学模型方程：Y=-55.79889+0.73552X1+0.96990X2+1.22742X3-0.00981X12-0.01124X22-0.01056X32-0.00253X1X2.方差分析表明各因素对灵芝孢子粉多糖提取率的影响强弱顺序为：超声温度>超声时间>料液比.得出的实验最优方案为：料液比1∶34，提取时间36 min，提取温度54 ℃.在此最佳条件下，灵芝孢子多糖的提取率为11.253%.【相关文献】[1] 李晓冰，赵宏艳，郭栋．灵芝多糖药理学研究进展[J]．中成药，2012，34(2)：332-335．[2] 王君巧，聂少平，余强，等．黑灵芝多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节和抗氧化作用[J]．食品科学,2012，30(23)：274-277．[3] 朱科学，聂少平，宋丹，等．黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠血糖、血脂及肠系膜上动脉病变改善作用[J]．食品科学，2013，34(23)：300-304．[4] 韩建军，宁娜．灵芝的化学成分与药理作用研究进展[J]．广州化工，2014(23)：18-19．[5] 李凡姝，张焕丽，马慧，等．超声辅助提取灵芝多糖的工艺研究[J]．农业技术与装备，2016，321(9)：7-11．[6] 唐启义. DPS数据处理系统[M].北京：科学出版社,2010：246-248．[7] 刘涛，尼玛卓玛，尼珍，等.苯酚-浓硫酸法测定西藏天麻中多糖含量的条件优化[J].广东农业科学，2011，33(8)：132-134.[8] 于立芹,刘婕,卢奎,等.红薯叶多糖提取工艺的优化[J].河南工业大学学报，2008，29(1)：37-41.[9] 邓辰辰，相继芬，董兴叶，等.亚临界水提取灵芝多糖的工艺研究[J].河南工业大学学报(自然科学版)，2016，37(2)：105-108.[10] 梁英，何搵娟，韩鲁佳．二次回归正交旋转组合设计对黄芩多糖提取工艺的优化[J].食品科学，2009，30(24)：104-107.[11] ZHENG X Z，XU X W，LIU C H，et al．Extraction characteristics and optimal parameters of anthocyanin from blueberry powder under microwave-assisted extraction conditions[J]．Separation & Purification Technology，2013，104(5)：17-25.。

２００７年第１２期总第１７７期中国酿造乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）是由某些乳酸链球菌所产生的一类多肽化合物，摩尔质量为７０００￣１０００００［１］。

Ｎｉｓｉｎ在酸性介质中具有良好的稳定性，在ｐＨ３￣７随着ｐＨ值升高，Ｎｉｓｉｎ分子会变得愈加不稳定。

Ｎｉｓｉｎ对蛋白水解酶特别敏感，进入人体后，在消化道内被胃蛋白酶水解，是一种安全的生物防腐剂［２］。

通过测定乳酸链球菌素抑菌圈大小，采用４元２次回归正交旋转组合设计得到了最优化的乳酸链球菌发酵培养基。

１材料与方法１．１材料菌株：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ（乳酸链球菌）为乳球菌素的生产菌株；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（金黄色葡萄球菌）为乳球菌素检测指示菌。

种子培养基：牛肉膏０．５％，蛋白胨１％，ＮａＣｌ０．５％，ｐＨ７．２￣７．４。

发酵培养基：蔗糖１％，蛋白胨２％，酵母膏１％，ＫＨ２ＰＯ４３％，ＮａＣｌ０．２％，ＭｇＳＯ４０．０２％，ｐＨ６．９。

１．２方法１．２．１发酵根据代谢发酵控制原理，采用２次回归正交旋转组合设计，确定４种主要成分：蔗糖，蛋白胨，酵母，ＫＨ２ＰＯ４。

根据４因子２次正交旋转组合，设计３６套发酵培养基配方。

从回转式恒温调速摇床柜中取下种子培养液，通过镜检验证是否培养出菌种，将其放入超净台中，每瓶发酵培养基以５％的接种量从种子培养液中用移液管吸２．５ｍＬ放入其中，接种后将３６瓶发酵培养液放入回转式恒温调速摇床柜中，３０℃（１００ｒ／ｍｉｎ）振荡培养１２ｈ。

１．２．２管碟法测效价［３］从电热恒温培养箱中取出４支新鲜的金黄色葡萄球菌用无菌水分别洗下斜面上的菌种，待培养基冷却后，将金黄色葡萄球菌的菌悬液到入三角瓶中，轻轻摇匀，倒平板。

用３６支移液管分别从３６支试管中吸５ｍＬ液体放入对应的３６支０．０２ｍｏｌ／Ｌ稀ＨＣｌ，制成稀释１倍的低浓度液体。

取７５μＬ，滴牛津杯，放入３０℃电热恒温培养箱培养１８ｈ，测量结果。

２试验结果２．１发酵培养基优化［４－６］试验设计及计算：采用４元２次回归正交旋转组合乳酸链球菌发酵培养基的优化吴疆，金红，童应凯，韦东胜（天津农学院农学系，天津３００３８４）摘要：对乳酸链球菌发酵产生乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）的培养基进行了优化研究，根据代谢发酵控制原理，采用二次回归正交旋转组合设计，考查了乳酸链球菌摇瓶发酵培养基中４种主要成分对乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）产量的影响，通过ＤＰＳ软件获得最佳发酵培养基配比为蔗糖０．４％，蛋白胨１．２％，酵母浸出膏０．４％，ＫＨ２ＰＯ４０．５％。