重组质粒的诱导表达——表达宿主菌的选择

原核表达操作步骤及注意事项将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT- PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。

以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。

常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。

2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。

3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。

4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。

培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。

5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。

6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。

破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。

同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。

7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。

此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。

8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。

确保表达的目标蛋白符合预期。

9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。

根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。

需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。

不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。

此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。

8。

大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚,目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具.因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的.本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点,归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验,总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。

8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1。

1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子,如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等.根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。

融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性,促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化,或者实现目标蛋白的表达定位。

常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly—Arg,Poly—His, Strep—Tag Ⅱ，S—tag，MBP等.其中His—Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。

His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。

His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。

目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。

除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S—转移酶是另一种实验室常用的融合标签.它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化.此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠,提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。

原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。

在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。

常用的有温度诱导和药物诱导。

本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。

( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

（3）10 mg / mL 溶菌酶。

（4）脱氧胆酸。

（5）1 mg / mL DNase I。

2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。

重组蛋白诱导表达方法一、基因克隆和表达载体构建基因克隆是重组蛋白诱导表达的第一步，包括基因的获取、基因的剪切和拼接等步骤。

在获取基因时，可以通过基因文库筛选、PCR 扩增、人工合成等方法。

剪切和拼接基因时，需要选择合适的限制性内切酶和连接酶，以确保基因的准确拼接。

表达载体的构建是将克隆的基因插入到载体中，以使基因在宿主细胞中表达。

常见的载体包括质粒、噬菌体、病毒等，根据基因的大小和表达需求选择合适的载体。

二、宿主菌的选择和转化宿主菌是用于表达重组蛋白的微生物细胞，根据基因的表达需求选择适合的宿主菌。

将构建好的表达载体导入宿主菌中，使基因在宿主菌中表达。

转化方法包括电转化、化学转化、显微注射等。

三、重组蛋白的表达诱导将转化后的宿主菌进行培养，在适当的温度、pH、营养等条件下，诱导重组蛋白的表达。

根据不同的宿主菌和载体，选择合适的诱导剂和诱导条件。

四、重组蛋白的分离和纯化重组蛋白在宿主菌中表达后，需要进行分离和纯化，以获得高纯度的蛋白质。

分离和纯化方法包括离心、沉淀、过滤、离子交换、亲和层析等。

五、重组蛋白的检测和鉴定通过电泳、免疫学、质谱等技术对重组蛋白进行检测和鉴定，以确定蛋白质的分子量、等电点、抗原性等性质。

六、重组蛋白的应用和功能研究重组蛋白具有广泛的应用价值，可用于制备抗体、研究蛋白质的结构和功能、开发新药等。

同时，通过对其功能的研究，可以深入了解蛋白质的作用机制和生物学过程。

七、重组蛋白的表达优化为了提高重组蛋白的表达量和纯度，需要进行表达优化。

包括选择适合的宿主菌和载体、调整培养条件、优化诱导条件等。

同时，可以通过蛋白质工程手段对蛋白质进行改造，以提高其表达量和稳定性。

目的基因在大‎肠杆菌中的诱‎导表达一般程序如下‎：获得目的基因‎－准备表达载体‎－将目的基因插‎入表达载体中‎（测序验证）－转化表达宿主‎菌－诱导靶蛋白的‎表达－表达蛋白的分‎析－扩增、纯化、进一步检测。

[主要试剂]1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于‎100ml ddH2O 中‎,0.22μm滤膜‎抽滤，-20℃保存。

[操作步骤]1、通过PCR方‎法获得目的基‎因：以含目的基因‎的克隆质粒为‎模板，按基因序列设‎计一对引物（在上游和下游‎引物分别引入‎不同的酶切位‎点，本实验中为B‎a mHⅠ和Hiind‎Ⅲ），PCR循环获‎得所需基因片‎段。

PCR反应体‎系为：模板（含R基因的重‎组质粒）1μl上游引物PR‎11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCR buffer‎（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O补‎至100μlPCR反应条‎件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40se‎c、72℃延伸1min‎，30个循环；最后72℃延伸8min‎。

2、构建重组表达‎载体（1）载体酶切：将表达质粒p‎R SETA用‎限制性内切酶‎（同引物的酶切‎位点）进行双酶切，酶切产物行琼‎脂糖电泳后，用凝胶回收K‎i t或冻融法‎回收载体大片‎段。

（2）R基因PCR‎产物双酶切后‎回收，在T4 DNA连接酶‎作用下连接入‎载体。

连接反应体系‎为：pRSETA‎1μlR基因片段3μlT4 DNA连接酶‎（5U/μl）1μl5×buffer‎2μlddH2O补‎至10μl3、获得含重组表‎达质粒的表达‎菌种（1）将连接产物转‎化大肠杆菌D‎H5α，根据重组载体‎的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量‎抽提质粒，双酶切初步鉴‎定。

（2）测序验证目的‎基因的插入方‎向及阅读框架‎均正确,进入下步操作‎。

一、DNA提取1、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

二、RNA提取1、实验原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。

在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA2、操作步骤1、取植物嫩叶,液氮研磨,每1.5ml tube分装0.1克样品;2.每管加入0.5ml Trizol液,迅速混匀,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

3、室温下静置5~10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离4、加入O.5mI的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,室温静置5分钟5、10000r/min离心10分钟6、取上清液(水相)转入一新的离心管,加入等体积异丙醇,室温放置10分钟,10000r/min离心10分钟。

7、弃去上清液,加入至少1ml的70乙醇,涡旋混匀,4℃下7500r/min离心5分钟。

8、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5—10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。

然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中,必要时可55℃—60℃水溶10分钟。

原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。

②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。

在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。

2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。

只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。

做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。

（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。

简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。

以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。

质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。

2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。

这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。

3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。

选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。

4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。

这一步通常涉及DNA 连接酶。

5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。

这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。

质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。

6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。

这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。

7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。

8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。

这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。

9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。

这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。

整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。

这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。

异源表达异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合⽬的基因另外重组⼯程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：1。

以质粒的形式存在于菌体⾥，以质粒表达这种⼀般保存还是容易的，多数情况下⽤抗⽣素压着就问题不⼤，⽽且直接⽤质粒保存，⽤时现转也能顺利表达的情况也有的是2。

重组在宿主基因组中，与宿主蛋⽩⼀起表达这就保存起来⽐较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿⼏代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插⼊的位点在宿主基因组的⾮活跃区域，过⼏代就基因沉默了。

⼀般个⼈认为可以⼀试的⽅法包括(1)⽤抗⽣素传代、保菌后抗⽣素复苏等等(2)得到⼯程菌后第⼀代就保10管，取⼀管传⼀代再保10管，再取⼀管做使⽤菌株，也就是保存最原始的菌种(3)筛选时多筛点，⼏⼗个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜⼀般没那个精⼒)还能保留表达能⼒的算相对⽐较稳定了异源蛋⽩的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，⽽且由于蛋⽩本⾝千差万别，很难有⼀个很完善或很标准的流程⽅法。

另外，表达的宿主也是多种多样，⽬前⽐较常⽤的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆⾍细胞，哺乳动物细胞等，各⾃有着其本⾝的特点，优缺点各异。

但是，异源表达⼜是分⼦⽣物学中很重要的⼀个⼯具，园⼦⾥不少战友都在做这⽅⾯的⼯作，许多帖⼦在讨论这⽅⾯的问题。

因此想发起⼀个针对这⽅⾯的专题讨论，希望有助于⼤家的⼯作，当然也希望能对⾃⼰的⼯作有所帮助，欢迎⼤家讨论。

还有，由于本⼈只做了有关E.coli和甲醇酵母的⼯作，其他虽然我们研究所也有⼈做，但毕竟本⾝没做过，若有错误或不严谨的地⽅欢迎战友们指正。

⾸先在这⾥提出⼏⽅⾯问题，希望⼤家讨论：1. 宿主的选择。

表达宿主虽众多，但⽐较常⽤的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆⾍细胞，哺乳动物细胞等，各⾃代表了⼀种体系。

分⼦⽣物学实验报告PCR基因扩增实验⽬的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)，是⼀种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的⽅法，故⼜称为基因的体外扩增法。

在待扩增的DNA⽚断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退⽕和延伸若⼲个循环后，DNA扩增2的n 次⽅倍。

实验仪器：基因扩增仪移液器实验试剂：10×PCR缓冲液(含Mg2＋)4种dNTPTaq酶DNA模板两种引物（正向引物和反向引物）实验步骤:`1、按顺序向微量离⼼管中依次加⼊：ddH2O 20µlDNA 样品5µl10×PCR 缓冲液5µldNTP 4µl引物I 5µl引物Ⅱ5µl混匀。

2、PCR反应参数(1) 94℃变性2min(2) 94℃变性30sec，(3) 66℃退⽕30sec，(4) 72 ℃延伸1min。

(5) 重复(2)-(4)40次（6）72 ℃延伸7min。

（7）4℃保存3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10µl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。

保持电流40mA。

电泳结束后，⽤EB染⾊15min，紫外灯下观察结果。

实验结果：照⽚结果图1 2 3 41.10ul样品2.样品3.DNA相对分⼦质量标准4.对照DNA琼脂糖凝胶电泳实验⽬的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的⽅法和技术。

实验原理：DNA分⼦在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分⼦筛效应，DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作⽤下朝正极移动。

在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有⼀定孔径，长度不同的DNA分⼦由于所受凝胶的阻遏作⽤⼤⼩不⼀，迁移的速度不同，从⽽可以按照分⼦量⼤⼩得到有效分离。

在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应，即分⼦本⾝的⼤⼩和构型。

1、下列有关基因的叙述，错误的是【 A 】A 蛋白质是基因表达的唯一产物B 基因是 DNA 链上具有编码功能的片段C 基因也可以是 RNAD 基因突变不一定导致其表达产物改变结构2、基因工程的单元操作顺序是【 B 】A 增，转，检，切，接B 切，接，转，增，检C 接，转，增，检，切D 切，接，增，转，检3、生物工程的上游技术是【 A 】A 基因工程及分离工程B 基因工程及发酵工程C 基因工程及酶工程D 基因工程及细胞工程4、下列各组专业术语中，含义最为接近的是【 C 】A 终止子与终止密码子B 基因表达与基因转译C DNA 退火与 DNA 复性D 重组子与转化子5、根据酶切活性对盐浓度的要求，限制性核酸内切酶可分成【 B 】A 2 大类B 3 大类C 4 大类D 5 大类6、T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是【 D 】A 2' -OH 和 5' – PB 2' -OH 和 3' -PC 3' -OH 和 2' – PD 5' -OH 和 3' -P7、下列有关连接反应的叙述，错误的是【 A 】A 连接反应的最佳温度为37 ℃B 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%C 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mMD 连接酶通常应过量 2-5 倍8、原生质体转化方法不大适用于【 A 】A 大肠杆菌B 枯草杆菌C 酵母菌D 链霉菌9、下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是【 A 】A Cosmid >λ-DNA > PlasmidB λ -DNA > Cosmid > PlasmidC Plasmid >λ -DNA > CosmidD Cosmid > Plasmid > λ-DNA10、若某质粒带有 lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入【 D 】A 半乳糖B 异丙基巯基 - β - 半乳糖苷( IPTG )C 蔗糖D 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - β -D- 半乳糖苷( X-gal )11、下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是【 C 】A 大肠杆菌－繁殖迅速B 枯草杆菌－分泌机制健全C 链霉菌－遗传稳定D 酵母菌－表达产物具有真核性12、分子杂交的化学原理是形成【 D 】A 共价键B 离子键C 疏水键D 氢键13、某一重组 DNA ( 6.2 kb ) 的载体部分有两个 SmaI 酶切位点。

原核表达之宿主菌株选择指南在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。

事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因——即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。

作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。

每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。

宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？知其然还要知其所以然。

比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。

堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。

大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。

真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。

改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

（已经携带有氯霉素抗性质粒）当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。

原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。

原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。

下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。

当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。

但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。

以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。

根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。

根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。

对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

~复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。

表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。

原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。

2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。

α淀粉酶重组菌的构建及表达
α淀粉酶重组菌的构建及表达通常需要经过以下步骤：
1. 构建重组质粒：将α淀粉酶基因插入质粒中，并通过酶切验证基因序列的正确性。

常用的质粒载体包括pET、pGEX等，这些载体具有表达载体、选择标记和多克隆位点等功能。

2. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化到宿主菌中，常用的宿主菌包括大肠杆菌、枯草杆菌等。

3. 筛选重组菌：在选择性培养基中培养宿主菌，筛选出含有重组质粒的菌株。

常用的选择性培养基包括IPTG、X-gal 等。

4. 表达重组蛋白：将重组菌在适当的温度、pH和营养条件下培养，使其表达重组蛋白。

常用的表达系统包括诱导表达、强制表达等。

5. 纯化重组蛋白：通过各种纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等，从宿主菌中纯化出重组蛋白。

6. 检测重组蛋白：通过各种检测方法，如SDS-PAGE、Western blot等，检测重组蛋白的表达和纯度。

总之，α淀粉酶重组菌的构建及表达需要经过多个步骤，需要掌握相关的分子生物学和微生物学知识，并使用各种实验技术进行操作。

重组人干扰素生产工艺一、简介重组人干扰素（Interferon）是一类重要的免疫调节蛋白，在生物制药领域具有广泛的应用，特别是在抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等方面。

重组人干扰素生产工艺是指利用基因工程技术，将人体细胞中制造干扰素的基因导入细菌、真菌或动植物细胞中，并通过发酵、提取等步骤最终制备重组人干扰素的过程。

本文将介绍重组人干扰素生产工艺的关键步骤、技术原理及优化方法。

二、生产工艺步骤1.基因克隆和表达载体构建：–选择适合的重组表达宿主菌，如大肠杆菌、毕赤酵母等。

–将编码重组人干扰素的基因克隆到表达载体中，构建表达载体。

–将表达载体导入宿主菌细胞中，实现干扰素基因的表达。

2.发酵过程：–设计合适的培养基，满足宿主菌的生长和表达需求。

–进行适当的培养条件控制，如温度、pH值、氧气供给等。

–监测培养过程中的生长情况和干扰素的表达水平。

3.重组人干扰素的提取与纯化：–通过离心、超滤等方法将细菌或细胞破碎，释放干扰素。

–采用亲和层析、离子交换层析等技术进行干扰素的纯化和富集。

–进行最终的纯化步骤，得到高纯度的重组人干扰素。

三、关键技术原理•基因克隆：利用PCR扩增目的基因，将其插入适当的表达载体中。

•表达调控：通过调控启动子、转录子等元件来控制干扰素基因的表达水平。

•蛋白质纯化：利用蛋白质的生物特性，如大小、电荷等，选用不同的层析技术进行纯化。

四、工艺优化方法1.菌种优化：选择高表达、稳定的宿主菌株，优化质粒结构。

2.培养条件优化：根据宿主菌的生长情况，调整培养基成分和培养条件。

3.表达调控：利用诱导剂、转录启动子等手段调控干扰素基因的表达水平。

4.提取纯化优化：优化破碎、纯化过程，提高干扰素的产率和纯度。

五、结论重组人干扰素的生产工艺是一项复杂而重要的技术，通过不断优化工艺流程和条件，可以提高干扰素的产量和纯度，满足临床和市场需求。

未来随着基因工程技术的不断发展，重组人干扰素生产工艺将进一步精细化和高效化，为人类健康带来更大的益处。

细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分，也是细胞功能的核心执行者。

为了研究和应用不同类型的蛋白质，科学家发展出了各种蛋白质表达系统。

其中，细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。

本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。

一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。

这个系统主要包括以下几个重要组成部分：表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。

1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。

这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。

其中，启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。

反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性，并促进其在细菌中的高效表达。

2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用，通常选择大肠杆菌作为宿主，主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。

此外，大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低，有利于保护外源蛋白质的稳定性。

3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。

通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。

化学诱导通常通过添加一种诱导剂，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活载体中的启动子。

温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。

4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。

常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。

这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。

二、优势与其他蛋白质表达系统相比，细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势：1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。

通过优化表达条件和使用高效的诱导系统，可以实现高产量的蛋白质表达。

此外，细菌本身的生长速度也有助于高效表达。

2. 便捷性相比其他表达系统，细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。