重组蛋白表达系统详细版
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细菌的重组蛋白质表达系统
细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分，也是细胞功能的核心执行者。
为了研究和应用不同类型的蛋白质，科学家发展出了各种蛋白质表达系统。
其中，细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。
本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。
一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。
这个系统主要包括以下几个重要组成部分：表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。
1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。
这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。
其中，启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。
反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性，并促进其在细菌中的高效表达。
2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用，通常选择大肠杆菌作为宿主，主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。
此外，大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低，有利于保护外源蛋白质的稳定性。
3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。
通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。
化学诱导通常通过添加一种诱导剂，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活载体中的启动子。
温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。
4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。
常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。
这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。
二、优势与其他蛋白质表达系统相比，细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势：1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。
通过优化表达条件和使用高效的诱导系统，可以实现高产量的蛋白质表达。
此外，细菌本身的生长速度也有助于高效表达。
2. 便捷性相比其他表达系统，细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
重组蛋白表达体系
重组蛋白表达体系
目
CONTENCT
录
• 重组蛋白表达体系概述 • 重组蛋白表达体系的组成与构建 • 重组蛋白的表达方式与策略 • 重组蛋白的表达产物检测与分析 • 重组蛋白表达体系的挑战与解决方
案 • 重组蛋白表达体系的未来展望
01
重组蛋白表达体系概述
定义与重要性
定义
重组蛋白表达体系是指通过基因工程技术，将外源基因在宿主细 胞中表达并产生相应蛋白质的过程。
提高表达产物的产量与纯度
高密度培养技术
01
通过优化培养条件，提高宿主细胞的生长密度，从而提高重组
蛋白的产量。
蛋白质纯化技术
02
利用先进的蛋白质纯化技术，如亲和色谱、离子交换等，提高
重组蛋白的纯度。
蛋白质折叠与修饰
03
研究蛋白质折叠与修饰机制，优化重组蛋白的稳定性与功能。
重组蛋白表达体系在生物医药领域的应用前景
01
02
03
04
药物研发
利用重组蛋白表达体系生产具 有生物活性的药物，如单克隆 抗体、酶抑制剂等。
疫苗研发
通过表达病原体抗原或相关蛋 白，用于疫苗的研制和生产。
疾病治疗
利用重组蛋白表达体系生产具 有治疗作用的蛋白质，如生长 因子、细胞因子等。
生物材料
利用重组蛋白表达体系生产具 有特定功能的生物材料，如蛋 白质支架、纳米颗粒等。
表达产物的纯化问题
总结词
表达产物的纯化是重组蛋白表达体系中的另 一个挑战，它涉及到如何有效地分离和纯化 目标蛋白。
详细描述
表达产物的纯化问题通常与目标蛋白的溶解 性、稳定性以及与其他蛋白质的相互作用有 关。为了解决这一问题，研究人员可以采用 多种纯化方法，如离子交换、凝胶过滤、亲
目
CONTENCT
录
• 重组蛋白表达体系概述 • 重组蛋白表达体系的组成与构建 • 重组蛋白的表达方式与策略 • 重组蛋白的表达产物检测与分析 • 重组蛋白表达体系的挑战与解决方
案 • 重组蛋白表达体系的未来展望
01
重组蛋白表达体系概述
定义与重要性
定义
重组蛋白表达体系是指通过基因工程技术，将外源基因在宿主细 胞中表达并产生相应蛋白质的过程。
提高表达产物的产量与纯度
高密度培养技术
01
通过优化培养条件，提高宿主细胞的生长密度，从而提高重组
蛋白的产量。
蛋白质纯化技术
02
利用先进的蛋白质纯化技术，如亲和色谱、离子交换等，提高
重组蛋白的纯度。
蛋白质折叠与修饰
03
研究蛋白质折叠与修饰机制，优化重组蛋白的稳定性与功能。
重组蛋白表达体系在生物医药领域的应用前景
01
02
03
04
药物研发
利用重组蛋白表达体系生产具 有生物活性的药物，如单克隆 抗体、酶抑制剂等。
疫苗研发
通过表达病原体抗原或相关蛋 白，用于疫苗的研制和生产。
疾病治疗
利用重组蛋白表达体系生产具 有治疗作用的蛋白质，如生长 因子、细胞因子等。
生物材料
利用重组蛋白表达体系生产具 有特定功能的生物材料，如蛋 白质支架、纳米颗粒等。
表达产物的纯化问题
总结词
表达产物的纯化是重组蛋白表达体系中的另 一个挑战，它涉及到如何有效地分离和纯化 目标蛋白。
详细描述
表达产物的纯化问题通常与目标蛋白的溶解 性、稳定性以及与其他蛋白质的相互作用有 关。为了解决这一问题，研究人员可以采用 多种纯化方法，如离子交换、凝胶过滤、亲
重组蛋白真核表达系统构建流程
重组蛋白真核表达系统构建流程蛋白质是生物体内具有重要生物学功能的分子，它们由氨基酸组成，对细胞的结构和功能起着重要的调控作用。
在生物科学研究和生物制药工业中，重组蛋白质的生产和表达是一个重要的研究领域。
真核系统是重组蛋白质表达的一个重要平台，它具有许多优点，如能够实现复杂的蛋白修饰和折叠等。
因此，构建真核表达系统是生物科学研究和生物工程应用中的一个重要课题。
一、选取重组蛋白质的编码序列在构建真核表达系统之前，首先需要选取重组蛋白质的编码序列。
这一步骤通常是通过将目标蛋白质的编码基因进行克隆和序列分析来完成的。
在进行基因克隆过程中，需要选择适当的限制性内切酶和载体，构建一个含有目标基因的重组质粒。
同时，对目标基因的序列进行分析可以帮助确定转录和翻译起始位点、信号肽序列、保守结构域等信息，这些信息对于真核细胞的表达和翻译过程具有重要意义。
二、选择适当的真核表达宿主真核表达系统可以选择多种宿主来进行表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母等。
在选择表达宿主时，需要考虑到宿主细胞的生长特性、表达能力、蛋白修饰能力等因素。
不同的宿主对于重组蛋白质的表达和折叠能力有所差异，因此需要根据目标蛋白质的性质和需求来选择合适的宿主。
通常来说，哺乳动物细胞系统是真核表达系统中最常用的宿主之一，它具有较高的蛋白修饰和折叠能力，适合用于表达复杂的蛋白质。
三、构建真核表达载体在选择了合适的宿主后，需要构建一个含有目标基因的真核表达载体。
真核表达载体通常包括启动子、转录终止子、筛选标记基因等功能元件。
通过将目标基因插入到表达载体中，可以实现对目标基因的调控和表达。
同时，表达载体还可以包括一些辅助元件，如信号肽、翻译起始位点、融合标签等，以提高重组蛋白质的表达水平和纯度。
四、转染或转化真核细胞在构建了真核表达载体后，需要将其转染或转化到真核细胞中。
转染是指将外源DNA通过化学方法导入到细胞内，而转化则是通过质粒介导的方式将外源DNA导入到细胞内。
大规模蛋白质表达研究的方法和技术
大规模蛋白质表达研究的方法和技术随着生物医学研究的不断深入，对蛋白质的兴趣也越来越浓厚。
蛋白质的表达研究成为了近年来热门的研究领域之一。
本文将重点介绍大规模蛋白质表达研究的方法和技术，以帮助读者更好地了解和应用于实际研究。
一、重组蛋白质表达系统重组蛋白质表达系统是大规模蛋白质表达研究中最常用的方法之一。
该系统利用真核或原核细胞来表达目标蛋白质，通过转染、转化等方式将外源基因导入细胞中，从而实现大量蛋白质的表达和纯化。
常见的重组蛋白质表达系统包括大肠杆菌、酵母等。
大肠杆菌表达系统具有高表达效率、操作简便等优点，适合于大规模表达和纯化蛋白质。
而酵母表达系统则适用于复杂蛋白质的表达和折叠，因其能够实现真核细胞级别的蛋白质表达。
二、蛋白质结构预测和模拟技术蛋白质结构的预测和模拟是大规模蛋白质表达研究中必不可少的一步。
通过结构预测和模拟技术，研究人员可以了解蛋白质的三维结构、功能以及相互作用方式，为后续的功能研究和药物研发提供重要参考。
常用的蛋白质结构预测和模拟技术包括蛋白质同源建模、分子动力学模拟等。
蛋白质同源建模通过比对已知结构蛋白质与目标蛋白质的序列相似性，用已知结构蛋白质的结构模板来推测目标蛋白质的结构。
而分子动力学模拟则通过模拟蛋白质分子的运动行为，从而研究蛋白质的结构和性质。
三、蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用是蛋白质功能调控的关键环节，研究蛋白质相互作用可以揭示蛋白质的功能机制和信号传递网络。
随着研究技术的不断发展，越来越多的方法被应用于蛋白质相互作用的研究。
蛋白质亲和纯化技术是蛋白质相互作用研究中常用的一种方法。
该方法通过蛋白质之间的特异性结合来分离纯化目标蛋白质及其相互作用蛋白质。
常用的蛋白质亲和纯化技术包括免疫共沉淀、亲和色谱等。
另外，蛋白质结构冷冻电镜技术也成为研究蛋白质相互作用的重要工具。
该技术能够在近原子分辨率下探究蛋白质复合物的结构，揭示蛋白质相互作用的机制。
四、蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术是大规模蛋白质表达研究中的新兴领域。
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4：常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和白不表达时：
2
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在pH9.0下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。
关于重组人血白蛋白的系统性表述
关于重组人血白蛋白的系统性表述人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。
随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。
根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。
但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。
用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。
一．什么是重组人血白蛋白1.定义通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。
2.rHSA的等级分类按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。
3.rHSA的表达系统分类白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。
（1）原核表达系统HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。
因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。
大肠杆菌重组蛋白表达流程
大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。
启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。
2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。
在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。
3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。
转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。
转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。
4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。
此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。
5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。
诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。
6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。
可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。
常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。
7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。
确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。
需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。
为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。
关于重组人血白蛋白的系统性表述
关于重组人血白蛋白的系统性表述人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。
随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。
根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。
但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。
用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。
一．什么是重组人血白蛋白1.定义通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。
2.rHSA的等级分类按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。
3.rHSA的表达系统分类白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。
（1）原核表达系统HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。
因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
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重组蛋白表达系统详细版
表2 常用E. coli表达菌株
重组蛋白表达系统详细版
1.2 质粒载体
• 大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体，质粒上的重要元件 包括复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号肽，融合 标签，筛选标记等（图1）。原核表达载体已经发展得比较 完善，有多种质粒可供选择(表4)。
• 复制子： • 复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下质粒
重组蛋白表达系统详细版
图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
重组蛋白表达系统详细版
重组蛋白表达系统详细版
• 早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个弱启 动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表达的 蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经典的lac启动 子。
拷贝数越高，重组蛋白的表达量就越高，但是高拷贝的质粒 也会严重影响宿主的生长，质粒本身也不稳定，容易丢失和 突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子，如 pSC101；表达载体通常选用高拷贝的复制子，如pCoE1， pMBI（pUC），等。如果需要进行多个质粒的共转化，就要 根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子，如pSC101 和pUC共表达。
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1.1 表达菌株
• 原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性 的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。
• 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用 大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等， 这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍 生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启动子，以 及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3 在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成 DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合 酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产， 继而质粒上的目的DNA开始转录。同时，还有一些特殊设计的菌株 以表达有特殊需要的重组蛋白，如甲硫氨酸营养缺陷型表达硒代 甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株表达毒性蛋白，补充了稀有密 码子的菌株表达真核蛋白等，表2给出了常用的大肠杆菌表达菌株。
• 启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有 很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿 主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的 高效表达。
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• 融Байду номын сангаас标签：
• 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用 的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如 果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能 够特异识别糖类，也不必引入标签。
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• 启动子：
• 表达重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强 弱、作用方式、调控方式和本底表达水平。 表达载体通常选用强启动子以提高表达量， 但弱启动子也有其优点，如降低本底表达、 增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。按照 作用方式，启动子可以分为两类：组成型表 达的启动子使宿主不停地表达重组蛋白，常 用于工业生产，如σS等；诱导型表达的启动 子使宿主仅在受到诱导（诱导剂、温度等） 时表达目的蛋白，诱导型启动子使重组蛋白 的表达容易控制，同时降低了外源蛋白对细 菌生长的影响。
重组蛋白表达系统
• 1.原核表达系统 • 2.酵母表达系统 • 3.昆虫细胞表达系统 • 4.哺乳动物细胞表达系统 • 5.转基因植物表达系统 • 6.转基因动物表达系统 • 7.表达系统的选择
重组蛋白表达系统详细版
一、 原核表达系统
• 原核表达系统发展完善、流程简单快速、 成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值 得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及 不需要翻译后修饰的真核蛋白。
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• 终止子：
• 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分 为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段720bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不 被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋 白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA 聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以 供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白 并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带 有翻译起始信号的外源基因需要终止子。
• 强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达到细胞 总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉伯糖，本 底表达量低，启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统中最高效的 启动子，pET表达系统即是以它为中心构建的。T7启动子来源于λ噬菌体， 专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合在宿主菌的基因组中。在λ 噬菌体溶源的表达宿主菌，如BL21（DE3）中，lacI抑制T7 RNA聚合酶的 表达，IPTG的加入可以解除这种抑制。当受到诱导时，T7 RNA聚合酶开始 表达并结合在T7启动子上，启动重组蛋白的表达。T7 RNA聚合酶活性很 高，转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，使其下游的重组蛋白得到高 效表达，其产率可以达到细菌总蛋白量的50%以上。T7lac启动子则在T7启 动子下游加入了一个lac操纵子，其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白 的编码序列。lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻断T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录，从而降低重组蛋白的本底表达水平。
• PL、cspA启动子使宿主菌能够进行温度依赖型的表达。在温度敏感型突变 体菌株中，PL等启动子使得宿主在30℃时抑制重组蛋白表达，而在42 ℃ 时诱导重组蛋白表达；cspA启动子则被高温（37℃）抑制，低温（10℃） 启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低了使用成本，同 时也降低了诱导剂对细胞的伤害。
表2 常用E. coli表达菌株
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1.2 质粒载体
• 大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体，质粒上的重要元件 包括复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号肽，融合 标签，筛选标记等（图1）。原核表达载体已经发展得比较 完善，有多种质粒可供选择(表4)。
• 复制子： • 复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下质粒
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图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
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• 早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个弱启 动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表达的 蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经典的lac启动 子。
拷贝数越高，重组蛋白的表达量就越高，但是高拷贝的质粒 也会严重影响宿主的生长，质粒本身也不稳定，容易丢失和 突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子，如 pSC101；表达载体通常选用高拷贝的复制子，如pCoE1， pMBI（pUC），等。如果需要进行多个质粒的共转化，就要 根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子，如pSC101 和pUC共表达。
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1.1 表达菌株
• 原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性 的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。
• 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用 大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等， 这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍 生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启动子，以 及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3 在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成 DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合 酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产， 继而质粒上的目的DNA开始转录。同时，还有一些特殊设计的菌株 以表达有特殊需要的重组蛋白，如甲硫氨酸营养缺陷型表达硒代 甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株表达毒性蛋白，补充了稀有密 码子的菌株表达真核蛋白等，表2给出了常用的大肠杆菌表达菌株。
• 启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有 很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿 主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的 高效表达。
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• 融Байду номын сангаас标签：
• 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用 的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如 果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能 够特异识别糖类，也不必引入标签。
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• 启动子：
• 表达重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强 弱、作用方式、调控方式和本底表达水平。 表达载体通常选用强启动子以提高表达量， 但弱启动子也有其优点，如降低本底表达、 增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。按照 作用方式，启动子可以分为两类：组成型表 达的启动子使宿主不停地表达重组蛋白，常 用于工业生产，如σS等；诱导型表达的启动 子使宿主仅在受到诱导（诱导剂、温度等） 时表达目的蛋白，诱导型启动子使重组蛋白 的表达容易控制，同时降低了外源蛋白对细 菌生长的影响。
重组蛋白表达系统
• 1.原核表达系统 • 2.酵母表达系统 • 3.昆虫细胞表达系统 • 4.哺乳动物细胞表达系统 • 5.转基因植物表达系统 • 6.转基因动物表达系统 • 7.表达系统的选择
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一、 原核表达系统
• 原核表达系统发展完善、流程简单快速、 成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值 得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及 不需要翻译后修饰的真核蛋白。
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• 终止子：
• 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分 为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段720bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不 被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋 白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA 聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以 供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白 并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带 有翻译起始信号的外源基因需要终止子。
• 强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达到细胞 总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉伯糖，本 底表达量低，启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统中最高效的 启动子，pET表达系统即是以它为中心构建的。T7启动子来源于λ噬菌体， 专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合在宿主菌的基因组中。在λ 噬菌体溶源的表达宿主菌，如BL21（DE3）中，lacI抑制T7 RNA聚合酶的 表达，IPTG的加入可以解除这种抑制。当受到诱导时，T7 RNA聚合酶开始 表达并结合在T7启动子上，启动重组蛋白的表达。T7 RNA聚合酶活性很 高，转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，使其下游的重组蛋白得到高 效表达，其产率可以达到细菌总蛋白量的50%以上。T7lac启动子则在T7启 动子下游加入了一个lac操纵子，其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白 的编码序列。lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻断T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录，从而降低重组蛋白的本底表达水平。
• PL、cspA启动子使宿主菌能够进行温度依赖型的表达。在温度敏感型突变 体菌株中，PL等启动子使得宿主在30℃时抑制重组蛋白表达，而在42 ℃ 时诱导重组蛋白表达；cspA启动子则被高温（37℃）抑制，低温（10℃） 启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低了使用成本，同 时也降低了诱导剂对细胞的伤害。