细菌蛋白提取方法(双向电泳用)

蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。

这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。

水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。

另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。

(测量过程要在一个小时内完成)。

例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。

a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。

使用前滤纸过滤。

比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。

蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis)过程与体会-3 二、一向电泳（13cm的holder）（1）取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl（2）将上述溶液加到holder 的两个电极之间。

（3）去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。

（4）在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。

（5）将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。

（6）设置仪器的运行参数：三、胶条的平衡（由一向到二向）（1）将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。

（2）将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。

（3）用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。

四、二向电泳（1）将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.（2）设置仪器的运行参数：五、平板胶的染色硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）（1）固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。

（2）敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。

（3）清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。

（4）银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。

（5）显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml去离子水。

（6）终止：5%的醋酸。

（7）照相分析。

（8）保存制作干胶。

药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0. 2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65μl/ml。

温莪术蛋白双向电泳技术的建立（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：周艳，张美玲，田自有，何宏章，金利泰，李校【摘要】目的：建立温莪术的双向电泳技术(2-DE)体系。

方法：采用TCA/丙酮沉降法提取蛋白，并用超速离心去除杂质。

采用固相pH胶条在IPGphor TM III等电聚焦系统上进行等电聚焦，采用Bio-Rad电泳仪进行SDS-PAGE电泳，以银染法染色。

结果：得到了上百个点的双向电泳图谱。

结论：本研究成功建立了温莪术蛋白双向电泳技术体系。

【关键词】蛋白提取;双向电泳;TCA/丙酮沉降法;超速离心Abstract: Objective: To establish the system of 2-D gel electrophoresis proteome of the leaf of Curcuma wenyujin. Methods: The total proteins of root were extracted with trichloroacetic acid (TCA)/acetone precipitation method and ultracentrifugation，and then separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE)，which was an IPGphor TM unit with immobile pH gradient strips used in and the Ettan TM DaltⅡsystemin SDS-PAGE. The 2-D gel was stained with silver. Results: Near hundred 2-D electrophorogram was gained by this method. Conclusion:A system of two-dimensional electrophoresis of curcuma wenyujin is successfully established.Key words: protein extraction;two-dimensional electrophoresis(2-DE);trichloroacetic acid(TCA)/acetone precipitation method;ultracentrifugationO’Farrell于1995年创立的聚丙烯酰胺双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis，2-DE)是目前分析组分复杂蛋白质分辨率最高的工具之一。

荧光差异显示双向电泳技术原理双向电泳是一种常用的蛋白质分离技术，通过电场的作用将蛋白质样品分离成不同的带状区域。

而荧光差异显示双向电泳技术则是在双向电泳的基础上，利用荧光染料对蛋白质进行标记，使得分离出的蛋白质带状区域能够以荧光的形式显示出来。

本文将详细介绍荧光差异显示双向电泳技术的原理及其在蛋白质研究中的应用。

荧光差异显示双向电泳技术的原理主要包括样品制备、电泳分离、荧光染色和荧光成像等步骤。

样品制备是荧光差异显示双向电泳的关键步骤之一。

样品制备的目的是将蛋白质从复杂的生物体中提取出来，并使其具备较好的电泳性质。

常见的样品制备方法包括胶束电泳法和硅胶柱层析法等。

胶束电泳法是通过洗涤剂将蛋白质从细胞中溶解出来，形成胶束溶液，再经过离心等步骤得到纯化的蛋白质样品。

硅胶柱层析法则是利用硅胶柱将蛋白质样品分离纯化，去除杂质。

样品制备的关键在于保证蛋白质样品的纯度和完整性，以便后续的电泳分离。

电泳分离是荧光差异显示双向电泳的核心步骤。

电泳分离是通过电场的作用将蛋白质样品分离成不同的带状区域。

由于蛋白质的分子量和电荷差异，蛋白质在电场中会产生不同的迁移速度，从而实现分离。

双向电泳是指在水平方向和垂直方向施加交叉电场，使得蛋白质样品能够同时在两个方向上进行迁移，从而增加了分离效果。

电泳分离的关键在于电场的施加和控制，以及电泳胶的选择和制备。

然后，荧光染色是荧光差异显示双向电泳的重要步骤之一。

荧光染色是通过将蛋白质样品与荧光染料结合，使得分离出的蛋白质能够以荧光的形式显示出来。

常用的荧光染料包括SYPRO Ruby、CyDye和FluorProtein等。

荧光染色的关键在于染料的选择和染色条件的优化，以确保荧光信号的强度和稳定性。

荧光成像是荧光差异显示双向电泳的最后一步。

荧光成像是通过荧光成像仪将荧光信号转化为图像，以便后续的分析和解读。

荧光成像的关键在于成像仪的选择和参数设置，以及荧光信号的采集和处理。

荧光差异显示双向电泳技术在蛋白质研究中具有广泛的应用。

¹双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。

关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库;减法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)022*******随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而生。

双向电泳(tw o 2dimensional electrophoresis,22D E)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广泛关注。

1 双向电泳的基本原理首先根据蛋白质等电点不同在pH 梯度胶中等电聚焦(isoelec tric f ocusing,IEF)将其分离,然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAG E)第二次分离。

根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE 分为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统称为IS O 2D A L T 。

其主要缺点是pH 梯度不稳定,重复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines 共聚,形成具有pH 梯度的凝胶,这种系统称为IPG 2D AL T 系统,该系统pH 梯度稳定,不依赖于外加电场,基本上克服了ISO 2D AL T 的主要缺点,无论是重复性和上样量均优于I SO 2D AL T;第三种是非平衡pH 梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis,NEPhG E),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。

双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1一、蛋白质组学概论随着人类基因组计划的实施，生命科学步入了后基因组时代，出现了不同于以往经典生物实验科学的全新的研究方式─“生物大科学”。

这种生物大科学的核心思想是整体性研究，即以生物体内某类物质为对象进行完整的研究。

过去对生命活动的研究仅限于研究细胞内个别的基因或蛋白质，而基因组学和蛋白质组学的目标则是细胞内全部的基因和蛋白质。

因此，生物大科学与经典实验生物学在研究思路上有一个重要的区别：前者通常不针对具体的生物学问题或科学假设，其目标主要是把全部研究对象测定清楚，被称为“发现的科学”（Disco very Science）；而后者属于“小科学”，其实施则离不开具体的生物学问题或科学假设，被称为“假设驱动的科学”(Hypothesis-drive n Science)。

显然，生物大科学与经典实验生物学各有其所长，前者“广”而后者“深”。

如何把这二者有机地结合起来，使得人们能够更深刻更全面的揭示生命复杂体系和行为，这是后基因组时代生命科学工作者面临的重要课题，系统生物学（Systems Biology）就是针对这样一个时代需求而产生的生命科学研究领域的一门新兴学科。

它以基因组学和蛋白质组学为基础，通过实验观察和数学建模的反复迭代过程来描述和预测生物系统的动态行为。

点此下载本文的PDF全文：双向电泳(two-dimensional electrophores is).pdf蛋白质组学是系统生物学的基础和组成部分之一，在后基因组学时代的地位尤为突出。

蛋白质组学的内容包括：表达蛋白质组学（express ion proteomics）、结构蛋白质组学（structural proteomics）和功能蛋白质组学（functional proteomics）。

双向电泳是蛋白质组学研究的经典方法之一，特别是对于表达蛋白质学的研究是不可缺少的手段。

双向电泳实验方案1.双向电泳总蛋白(培养细胞）提取方法：方案一细胞培养在10cm的培养皿中，待培养至80％左右密度时，细胞用预冷的PBS漂洗3次，加450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复吹打。

（折合在六孔板中，每孔加裂解液50μl）之后将样品用超声波细胞破碎仪超声处理超声时间为5s，间歇时间为10s，功率为100-120W，超声处理至溶液清澈无粘稠物为止，处理过程在冰浴中进行，超声处理后，4℃、25000g离心1h。

取上清进行蛋白质浓度测量，按实验所需的量分装后-80℃冰箱中保存。

（裂解液成分：8mol/L脲，65mmol/L DDT，4％CHAPS，40mmol/L Tris）方案二1.1试剂（1）抽提缓冲液9mol/L脲 5.4g4％CHAPS 0.4g0.5％IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech） 50.0μl50mmol/L DDT 0.077gH2O 加至10ml（2）IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech）(3) 磷酸盐缓冲液（PBS）,冰冻1.2仪器(1) 细胞刮刀（2）离心机（低温，低速）（3）滤纸（4）冰浴装置（5）超速离心机（低温）（6）漩涡混合器1.3细胞培养的GC-1 spg细胞1.4方法1.从培养皿中转移细胞：用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞，用5ml移液器将培养基和细胞转移至15ml离心管中。

2.480g、4℃离心沉淀细胞5min。

3.弃去上清，勿搅动沉淀要点：操作一下步骤时，所有细胞需保持冰冻状态；不离心或震荡时保持细胞在冰上。

4.离心管中加入10ml冰冻PBS,来回吹打重悬细胞。

5.480g、4℃再次离心细胞5min。

6.弃去上清，勿搅动沉淀。

7.重复步骤4-6两次。

8.在最后一次洗涤后，把离心管完全空干，用滤纸将沉淀上残留的PBS吸干。

9.用移液器将抽提缓冲液加到离心管中。

依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。

双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。

分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。

在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。

80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。

由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。

此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。

这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。

第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。

其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。

用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。

蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。

最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。

现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。

双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。

下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤：双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。

它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质，并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。

以下是一般的双向电泳操作步骤：1.确保准备充足的电泳装置，包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。

2.准备样品：将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理，包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。

将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。

3.将样品加载到电泳槽中：在准备好的电泳缓冲液中加入样品，然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。

注意，为了保持电泳稳定性，在样品孔加载样品后，要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。

4.进行等电点电泳：将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中，并在两侧分别连接正负极。

设置合适的电流和电压，开始进行等电点电泳。

在等电点电泳过程中，蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。

5.停止等电点电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为2-3小时。

等电点电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。

6.水平电泳：停止等电点电泳后，将样品塘从上清洗掉，并用水平电泳缓冲液进行冲洗。

然后，在两侧连接正负极，设置合适的电流和电压，开始水平电泳。

在水平电泳过程中，蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。

7.停止水平电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为4-5小时。

水平电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。

8.染色和图像采集：将分离完毕的样品进行染色，常用的染色方法包括银染和荧光染色。

然后，使用图像采集系统获取电泳图像，可根据需要调整采集参数。

9.数据分析和解释：通过对电泳图像的分析，包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等，将分离出来的蛋白质鉴定和定位。

10. 验证和验证：对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。

双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。

本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。

原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。

在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。

通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。

双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。

等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。

在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。

通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。

2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。

在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。

由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。

因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。

3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。

常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。

对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。

染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。

通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。

步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。

常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。

2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。

细菌总蛋白和膜蛋白提取方法一、从新鲜样品中提取总蛋白(简易法)1、自配裂解液( pH 8.5-9.0)：50 mM Tris-HC，l 2 mM EDTA, 100 mM NaC，l 0.5% Triton X-10Q调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100卩g/m溶菌酶，1卩l/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。

该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g 湿菌体。

2、将40ml菌液在12000g, 4C下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤 2 遍，沉淀加入1ml 裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎，采用300w, 10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3 次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1%SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting 结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol 裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8C下10000g离心15min,上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1mlTrizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min, 28C不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min, 28C下12000g离心10min，弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。

每1ml Trizol 加入2ml 洗液，室温放置20min, 2-8C下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。

最后加入2ml 无水乙醇，涡旋后室温放置20min, 2-8C下7500g离心5min,弃上清。

5、冷冻干燥5-10min, 1%SDS容液溶解，反复吹打，50C温浴使其完全溶解，2-8C下10000g离心10min去除不溶物。

蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。

2.加入8mLTris饱和酚（pH8.8）和8mL抽提液，在通风橱内研磨30s。

先加8mLTris饱和酚，Tris饱和酚会变成固体，此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。

接着加入8mL抽提液，也需将固体的抽提液研磨成小块。

等三者混匀后，将粉末转移至45 mL tube。

3.振荡30min。

室温静置，待tube中固体变成液体后，开始振荡。

振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。

4.10000g，4℃，10min。

将酚相（top phase）转移至45mL tube。

酚相（top phase）可置于冰上。

酚相应该是绿色的，水相应该是淡黄色的。

5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。

振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。

6.10000g，4℃，10min。

将酚相（top phase）转移至45mL tube。

7.沉淀酚相。

取一定体积（是酚相的5倍）的0.1M乙酸铵/甲醇溶液（–20℃保存）于酚相（45mL tube）。

振荡30s，–20℃培育1h或过夜。

8.清洗沉淀①15 min，20,000 g，4℃。

弃上清。

②加10mL 0.1 M乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。

–20℃沉淀30min。

③15 min，20,000 g，4℃。

弃上清。

④加入10 mL乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。

–20℃沉淀30min。

⑤15 min，20,000 g，4℃。

弃上清。

⑥加10mL 80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。

–20℃沉淀30 min。

⑦15 min，20,000 g，4℃。

弃上清。

⑧加入10 mL 80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。

–20℃沉淀30 min。

⑨15 min，20,000 g，4℃。

弃上清。

细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方PBS缓冲液一般作为溶剂氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM 3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM 0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。

Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06) 5M 3g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1） 40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。

其光吸收值与蛋白质含量成正比。

一、实验目的1. 掌握细菌蛋白提取的基本原理和操作方法。

2. 熟悉不同细菌蛋白提取方法的适用范围。

3. 学习细菌蛋白的纯化和鉴定方法。

二、实验原理细菌蛋白提取是指从细菌细胞中分离出蛋白质的过程。

细菌细胞壁主要由肽聚糖构成，细胞膜则由磷脂和蛋白质组成。

在提取细菌蛋白时，需要破坏细胞壁和细胞膜，使蛋白质释放到溶液中。

根据蛋白质的性质和来源，可以采用不同的提取方法。

三、实验材料1. 细菌菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）。

2. 实验试剂：Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶、电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250染色液、脱色液等。

3. 实验仪器：离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、PCR仪等。

四、实验方法1. 细菌培养：将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃恒温培养至对数生长期。

2. 细菌蛋白提取：（1）收集对数生长期的细菌，离心收集菌体。

（2）用预冷的Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）重悬菌体，加入适量的SDS-PAGE凝胶制备缓冲液。

（3）将菌悬液转移至匀浆管中，加入适量的超声波破碎试剂，进行超声波破碎。

（4）将破碎后的菌体置于冰浴中，离心收集上清液，即为提取的细菌蛋白。

3. 细菌蛋白纯化：（1）将提取的细菌蛋白上清液转移至柱层析柱中。

（2）根据蛋白质的特性和性质，选择合适的层析柱和洗脱缓冲液。

（3）通过层析柱分离纯化蛋白质。

4. 细菌蛋白鉴定：（1）将纯化的细菌蛋白进行SDS-PAGE电泳。

（2）将电泳后的凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色。

（3）观察蛋白质条带，并进行凝胶成像。

五、实验结果与分析1. 细菌蛋白提取结果：通过超声波破碎和离心，成功提取出细菌蛋白。

2. 细菌蛋白纯化结果：通过层析柱纯化，成功获得较纯的细菌蛋白。

3. 细菌蛋白鉴定结果：通过SDS-PAGE电泳，观察到目的蛋白条带，证实了细菌蛋白的提取和纯化。

六、实验讨论1. 细菌蛋白提取过程中，超声波破碎是关键步骤，可以破坏细胞壁和细胞膜，使蛋白质释放到溶液中。