高效液相色谱分类及工作原理(PPT课件)

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3．流动相
根据所使用的流动相和固定相的极性程 度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。
正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。其 流出顺序是极性小的先流出，极 性大的后流出。
反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性， 它适用于非极性化合物的分离， 其流出顺序与正相色谱恰好相反
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• 高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分 子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分 离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物 碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均 可进行分离分析定量。
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第一节 高效液相色谱法概述
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一、理论基础：速率理论
H A B Cu u
A为涡流扩散项 B/u分子扩散项 Cu项即传质阻力项
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⑶化学键合固定相：它是将各种不同有机基
团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产
生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以 认为它的出现是液相色谱法的一个重大突/4以上的分离问题是在化学 键合固定相上进行的。
X + nSad = Xad + nS
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达平衡时,有
Kad
[Xad][S]n [X][Sad]n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂 上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通 过吸附等温线数据求出。
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2．固定相
液－固吸附色谱所用固定相多是一些 吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧 化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多， 如线性容量较高，机械性能好，不溶胀， 与大多数试样不发生化学反应等，因此， 以硅胶用得最多。
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二、HPLC技术
采用高压输液泵，高效微粒固定相和高 灵敏度检测器。
三、HPLC特点
高压、高速、高效、高灵敏度、样品回 收方便。
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㈠经典LC与HPLC比较
柱之内径 长度 填充材料粒度 使用压力 分离时间
经典LC 1~5cm 50~100cm 150µm~200µm 1~10atm 0.5h~天
HPLC ~0.4cm 15~50cm 4µm~10µm 50~200atm ~10min
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二、液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱是以固体吸附剂作 为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体 颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。 液固色谱实质是根据物质在固定相上的 吸附作用不同来进行分离的。
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1．分离原理
当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂 表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当 试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在 固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已 被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面 发生竞争吸附:
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1．离子交换原理
离子交换色谱法是利用不同待测离子对 固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定 相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的 带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析 物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的 平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如 下：
第三章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
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• 生物材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化 学物质的混合物，所含成分在一万种以上，其 分子量从18到几百万，而且其中有意义的化学 成分的含量又往往很低，因此，必须要有一种 高分辨、高灵敏度的分离鉴定手段，气相色谱 和高压液相色谱具有以上特点，它们可通过对 生物样品和生物体液样品的有关成分的提取、 分离、分析定量，进行对疾病的早期快速诊断 的研究，病理病因的研究，以及药物在体内代 谢的研究……等。
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㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点
1.分析对象广
2. 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的 化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定 性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、 摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以 分析除永久气体外所有的有机和无机化合 物。
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⒉流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用，对
这类固定相由于颗粒很细，孔仍然 较浅，传质速率快，易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
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（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠载 体）：由直径为30 ~ 40m的实心玻璃球 和厚度约为1 ~ 2 m的多孔性外层所组成。 目前，这种载体粒度为5 ~ 10 m。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平 衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受限制。
组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对 组分产生相互作用力，相当于增加了一个 控制和改进分离条件的参数。
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⒊经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行 缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
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第二节 HPLC的主要类型
一、液一液分配色谱法（LLPC）
在液-液色谱中,流动相和固定相都是 液体,它能适用于各种样品类型的分离和分 析，无论是极性的和非极性的，水溶性和 油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。
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1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液
萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶 的液体中溶解度的不同，具有不同的分配 系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱 中进行的，使这种分配平衡可反复多次进 行，造成各组分的差速迁移，提高了分离 效率，从而能分离各种复杂组分。
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2.固定相
液液色谱的固定相由载体和固定液 组成。常用的载体有下列几类： （1）全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等 材料制成，直径约100 m的全多孔型颗 粒。
目前最广泛使用的还是5～10 m的全 多孔型微粒填料。
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3.流动相
一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。 在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极 性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性 弱的洗脱剂。
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三、离子交换色谱法（IEC）
此法是利用离子交换原理和液相色谱技 术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一 种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物 质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。 它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用 于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白 质等生物大分子。因此，应用范围较广。