mRNA差别显示技术

基因表达调控的一种方式。指 在对信号或诱导物做出应答时， 选择表达不同的基因，或使基 因的表达水平有所不同。
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5、基因扣除技术：
也称扣除cDNA克隆(subtractive cDN)得以实现的 。本 质是除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA 序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集， 提高了分离的敏感性。
来源样品之间转录水平的mRNA的定性和定量变化。
第四，能够检测那些彼此密切相关的RNA分子之间的表
达方面的差异，而这种RNA分子的有些种类在构建消减cDNA时已经丢失。.21
每种技术的诞生都不可能是完美的，mRNA差异显示技术 虽然从创立时起就很受欢迎，但是许多研究者发现该技术 存在一定缺陷，其中三点较为突出：
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三、mRNA差异显示技术的原理：
利用所有真核基因的mRNA 的3’端都有一段多聚腺苷酸 poly(A)尾结构的特点，将不同来源的总mRNA反转录合成 cDNA,此cDNA 合成是采用oligo(dT)12MN 为引物，其中M为 A,C,G中的任意一种，N为A,C,G 或T 中的任意一种，共有 12 种oligo(dT)12MN 引物，其中M为锚定碱基可增大引物 的Tm值，N 称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12 种 引物分别对同一总mRNA 样品进行cDNA 合成，即进行12 次 不同的反转录反应，得到12种类型的cDNA，从而也将总 mRNA分为12 个亚群。在此基础上对每一类cDNA进行随机引 物和相应的反转录引物PCR扩增，由于扩增的cDNA片段被放 射性同位素标记，因而利用放射自显影技术通过对不同组 织样品的同一类cDNA 的PCR 选择性扩增产物进行凝胶电泳 分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上的组织 特异性的表达。
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基因芯片
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7、基因表达系列分析
基因表达系列分析（SAGE）是通过快速和详 细分析成千上万个EST（express sequenced tags）来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序 列。在此方法中，通过限制性酶切可以产生非 常短的cDNA（10-14bp）标签，并通过PCR扩 增和连接，随后对连接体进行测序。SAGE大 大简化和加快了3’端表达序列标签的收集和测 序.
对mRNA差别显示技术的展望：
由于人们认识的基因还不够全面，特别是对生物发生、发 育及病理生理过程中某些新的功能基因和调控作用认识不足， 因此差异显示技术将在研究生物进化、损伤修复、癌变及治疗 反应过程中具有重要意义。差显技术的发现为在该领域中寻找 新基因提供了有用的工具。相信随着不断的应用和技术的不断 改善，差异显示技术必越来越多的在生命科学以及医学领域的 基因鉴定、克隆等方面起到更大的作用，对揭示生物界基因表 达调控的奥秘将起重要作用。
第一，操作步骤多，外源DNA污染严重而导致假阳性率 高，即差异片断用Northern杂交时无阳性信号，重复稳定 性较差。据研究，这种假阳性率可高达70％ 第二，获得的差异条带短小，多为300bp左右，并且多为 3’端非编码区序列（UTR），难以直接判断其功能和意义。 第三，必须采用放射性同位素标记反应，使得实验周期长、 成本高、易造成同位素污染，且不好回收差异片断。
mRNA差别显示技术
生物技术二班 方玉兵 09111082
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mRNA差别显示技术
主要内容
一、概述 二、基本概念 三、基本原理 四、实际应用
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一、概述：mRNA差别显示技术
高等生物大约有3~5 万个不同的基因，在每一个正常的体细 胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有 10%~20%的少部分基因被选择性表达，这种选择性表达是在发 育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心 机制。因此，比较不同组织之间，或相同组织在不同生理条件下， 或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异，可分离并克隆出这些 特异性表达的基因。近年来，该领域的研究取得了很大进展， 扣除杂交（subtractive hybridization, SH）、基因芯片技术 （DNA chip technique）、基因表达的系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、噬菌体全套抗体库技术(phage display antibody repertoire library technique)和双向电泳技术 (two-dimensional gel electrophoresis)先后成功地建立。
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18Biblioteka mRNA差异显示技术简略流程图
放射性自显影技术的概念：
放射性自显影法与普通照相的曝光、显影、定影 原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射 线使照相乳胶“感光”，再经显影和定影处理， 将乳胶中因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金 属银，洗去未“感光”的卤化银后则图像自然显 示出来。图像中任何区域的黑度取决于留存的金 属银的量，它反映了射线在这个区域所沉积的能 量。记录、检查和测量整体和组织、细胞和亚细 胞水平中放射性示踪物的分布、进行定性和半定 量测定，称为放射自显影法。
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mRNA差异显示PCR技术是1992年建立起来的一种 RNA指纹技术,是目前筛选差异表达基因最有效的方 法,可以提供生理状态下细胞的即时信息,揭示基因调 控在RNA水平的结果,它通过比较细胞对某一因素作 用前后在RNA水平的差别,确定在基因水平上细胞对 某些因素作用后的分子机制。
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二、基本概念：
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8、噬菌体抗体库技术
以噬菌体(主要是丝状噬菌体、λ噬菌体和T4噬菌体)为 载体,将抗体基因插入噬菌体编码的外壳蛋白基因PⅢ或 PⅥ中,在噬菌体表面以抗体－外壳蛋白融合蛋白的形成 表达。经辅助病毒感染后,借助蛋白PⅢ的信号肽穿膜作 用,进入宿主外周基质,在正确折叠后被包装于噬菌体尾 部,随后携带表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片 段的噬菌体颗粒。此抗体可以特异性识别抗原,又能够 感染宿主菌进行再扩增,将B细胞全套可变区基因克隆出 来,组装成噬菌体抗体的群体,则成为噬菌体抗体库技术。
换句话说，也就是我们在提取低风度的mRNA或者其 cDNA时是比较困难的，那么我们不用直接去提取我们的 目的DNA，而是通过除去体系的其他DNA，最终达到留 下我们所需DNA的目的。
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6、基因芯片技术：
基因芯片技术也称DNA微阵列技术（DNA microarray) ， 实际上就是一种大规模集成的固相杂交，是指在固相 支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接 将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地 固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对 杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列 及表达的信息)。由于常用计算机硅芯片作为固相支持 物，所以称为DNA芯片。
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2、RNA指纹：
RNA 首先在逆转录酶的作 用下使RNA 逆转录为DNA， 之后以其DNA 为模板，通过 以DNA指纹技术建立指纹图 谱进行分析。
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3、DNA指纹：
某些DNA序列的差异可通过限制性酶切 片段长度的改变反映出来，此即限制性片段 长度多态性(RFLP)。其主要原因是由于DNA 序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切 酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度 的酶切片段．
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mRNA差别显示技术应用的优势：
第一，实验要求的样品的用量较少（0.1～0.5μg）。
第二，因为此技术程序里包括PCR扩增步骤，因而更灵
敏地用于检测在组织或细胞中表达丰度极低的mRNA样
品的差异表达。
第三，因为从两种或更多的特定组织样品来源的扩增产
物在同一块胶上鉴定，因此能用于鉴定特定组织或细胞
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mRNA差异显示技术现在已经成功运用于动物的胚胎 发育、组织分化、生长因子激活与抑制、细胞周期控 制、癌变及疾病相关基因的鉴定和克隆，在植物无性 繁殖、形态发生、次生代谢、抗逆抗病等方面被用来 进行基因的鉴定、克隆以及功能研究，并取得很好的 结果。概括起来其主要用途可以归纳为以下三点： 第一，寻找差异表达的基因。 第二，研究个体、种群或品种间转录水平上的遗传变 异。 第三，鉴定经济动物中控制重要数量经济性状位点的 基因。
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mRNA差别显示技术
DNA指 纹
Jeffreys等用肌红蛋白基因的一个内含子 的串联重复序列作探针，从人的基因文 库中筛选出8个含有串联重复序列的重组 克隆。序列分析表明，这8个小卫星重复 单位的长度和序列不完全相同，但都有 相同的核心序列，他们先后用两个小卫 星探针进行Souther杂交，在低严谨条件 下杂交图谱的带型千差万刷，如人的指 纹一样．Jeffreys称之为DNA 指纹或遗传 指纹。
1、mRNA 差别显示
技术：
1992 年，Liang 和Padee 建立了以 PCR 为基础的mRNA 差异显示技术 （differential display reverse
transcription polymerase chain reaction, DDRT-PCR）。它是将 mRNA反转录技术与PCR技术二者相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱 技术。目前已广泛应用于分离鉴定组 织特异性表达的基因。
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9、双向电泳技术
双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等 电聚焦电泳和SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠—聚丙烯 酰胺凝胶电泳）的组合，即先进行等电聚焦电泳（按 照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大 小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自 的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离.
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DNA指纹图
图为41个红花檵木品种嫩叶DNA，红花檵 木为我国特产的一种优良园林绿化观赏植物