质粒提取

1.菌液接种到500ml培养基中，加抗生素至工作浓度，37℃，300rpm过夜

2.4000rpm，15min离心菌液收集菌体。

3.用20ml solutionⅠ溶解菌团，充分打散混合均匀。

4.称取0.1g溶菌酶加入菌液，室温放置5min。

5.加入40ml solution Ⅱ，轻轻混合至澄清,冰上放置5min。

6.加30ml solution Ⅲ，轻轻混匀，冰浴10min。

7.4000rpm，20min，离心后将上清液倒到200ml量筒里面。

8.加入0.6倍体积的异丙醇混匀并室温放置10min。10000rpm离心15min。

9.用6.5ml的TE重悬沉淀，转移到4个EP管中，13000rpm 离心5min。

10.上清转移到15ml的离心管中，加7.2gCsCl和 200ul的10mg/ml的EB，混匀。

11.在超速离心管中加样并封口。60000rpm 10℃离心16h。

12.用一个注射器在超速离心管中上面戳一个孔，留下针头，并用另外一个注射

器从红色质粒带旁边管壁戳进去，吸取1-1.5ml，装入新的离心管中。

13.加5ml TE饱和丁醇，混匀后静置各相分离后去掉上层桃红色丁醇，重复这一

步，直到下层水相中没有桃红色。转移下层水相到EP管中。

14.加入1/10体积5M的Nacl和2倍体积的无水乙醇。在-20℃下放置20min。

15.13000rpm，10min离心后去上清，重悬沉淀于1ml的TE然后转移至EP管。

16.用1倍体积的25/24/1的酚/氯仿/异戊醇抽提两次。

17.每管加1/10体积的2.5M的乙酸钠和2倍体积的乙醇， -20℃下放置20min。

13000rpm离心10min，然后用70%的乙醇轻轻润洗并晾干EP管。

18.重悬于1ml TE中，并在OD260下测量浓度。

LB培养基配方：

试剂1L

Tryptone(胰蛋白胨) 10g

Yeast extract（酵母膏；酵母提取物）5g

NaCl 5g

Agar（琼脂糖）15g

碱裂解法原理：

本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）

一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

1、用SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒 DNA和染

色体 DNA 两种 DNA 在强碱环境都会变性。

2、当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值后，质粒 DNA 迅速复性，

而染色体 DNA 分子巨大，难以复性。

3、通过离心，大部分细胞碎片、染色体 DNA RNA 及蛋白质沉淀（ SDS 的

作用下）除去，而质粒 DNA 留在上清中。

4、再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA 。

实验内容

所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：

1、培养细菌使质粒扩增。

2、收集和裂解细菌。

3、分离和纯化质粒DNA。

影响质粒提取的因素：

宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒的拷贝数，质粒的稳定性，抗生素，吸附柱的吸附量等。

宿主菌的种类：一般从宿主菌如DH5α，TOP10中可以得到高质量的质粒DNA，但也有些菌株有非常高的内切酶活性或裂解时产生大量的糖类，会降低质粒得

率。

培养时间：一般过夜（12-16h），最好不要超过16h，因为这时抗性开始下降，细胞开始裂解，使得质粒得率降低，也会导致质粒丢失或变异。

抗生素：在菌株的各阶段都应加入抗生素筛选，因为无质粒的细胞在无抗生素性时复制速度远大于含质粒的细胞。

抗生素贮存浓度（mg/ml）保存条

件（℃）严紧型质粒

（ug/ml）

松弛型质粒

（ug/ml）

氨苄青霉

素

50（溶于水）-20 20 100

羧苄青霉

素

50（溶于水）-20 20 100 氯霉素34（溶于无水乙醇）-20 34 170 卡那霉素10（溶于水）-20 10 50 链霉素10（溶于水）-20 10 50 四环素5（溶于无水乙醇）-20 10 50

质粒提取常见问题：

Q1：未提出质粒或得率低？

A1：大肠杆菌老化。重新涂平板，挑新克隆

A2：菌体中无质粒。有些质粒不能在某些菌体中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。

A3：碱裂解不充分。菌体过多导致裂解不充分，加倍Solution I，II，III的量。A4：乙醇残留。漂洗液洗涤后应离心尽量除出残留液体，再加入洗脱液洗脱。Q2：质粒纯度不高？

A1：混有蛋白。不要使用过多菌体。

A2：基因组DNA污染。加入Solution II，III后应温和混匀；不要剧烈震荡。 A3：加入Solution IIII不要过长，否则可能会有小片段DNA污染。

质粒(Plasmid)：

独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。质粒具有自主复制性、不相容性、多拷贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切酶单一识别位点等特点。它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒类型：

1、严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；

2、松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。