OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤(无内毒)

1.称取500 mg玻璃珠于2 mL离心管中，加入0.2~0.5 g的土壤样品（最好不要超过0.3 g）。

加入1 mL SLX Mlus Buffer。

快速研磨仪65 Hz研磨2 min（时间还需要摸索调整）。

2.加入100 μL DS Buffer涡旋混匀。

3.70 ℃水浴10 min，在水浴过程中快速涡旋一下。

对于一些难以溶解的菌体，提高温度到90 ℃。

(一般将水浴温度设定为80 ℃。

)4.常温下3000 rpm 离心 3 min。

将800 μL上清液移取到2 mL 离心管中，加入270 μL SP2 Buffer，涡旋彻底混匀。

5.冰浴5 min，4 ℃ 13000 x g 离心5 min。

6.小心吸取上清液移至2 mL 离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇。

反复颠倒20~30次混匀，将样品置于-20 ℃下 1 h。

7. 4 ℃ 13000 x g 离心10 min，沉淀DNA。

8.小心弃去上清液，确保没有丢失DNA颗粒。

将离心管倒置在吸水纸上1 min，除干液体。

9.加入200 μL Elution Buffer，涡旋10 s。

65 ℃水浴10~20 min 溶解DNA。

（具体时间根据离心管底部沉淀决定。

）10.加入50~100 μL HTR Reagent（由溶液颜色深度决定），涡旋10 s彻底混匀。

注意：HTR Reagent使用前需要摇晃瓶子使其混匀。

11.室温下静置2 min。

13000 x g 离心2 min。

12.将清澈的上清液移至2 mL 管中。

注意：如果上清液一直是土壤的暗色的话，重复步骤10~12 HTR的处理。

13.加入等体积的 XP2 缓冲液，涡旋混匀。

例如：如果第12步处理完溶液体积为250 μL，则加入250 μL XP2 缓冲液。

14.将第13步所得的液体涂到已装上收集管HiBind DNA Column 上。

10000 x g 室温离心1 min。

弃去流下的液体，收集管可以重新使用。

OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤以下是使用OMEGA小提试剂盒提取质粒的步骤：1. 打开Omega小提试剂盒，并将试剂瓶放置在室温下15-30分钟，以使其达到室温。

同时，将所需试剂加热至37°C，并准备其他必要的材料和试剂。

2.使用无菌技术，取出含有目标质粒的菌落并转移到15mL离心管中。

注射100-500µL的STET缓冲液（一种细胞裂解缓冲液）至离心管中。

3. 使用无菌技术，将质粒菌落悬浮液均匀涂布到2% Made by Omicron小鼠胚胎或其他适当的琼脂糖琼脂糖板（SD盘）上。

将板培养在37°C的培养箱中，24-48小时。

4.在培养后，用移液器或吸管轻轻吹气将质粒菌落悬浮液从SD盘转移到1.5mL（或2mL）离心管中。

5.离心细胞，以将固体与培养上清分离。

将离心条件设置为13,000×g，4°C，5分钟。

6.丢弃上清液并用1mLSTET缓冲液洗涤菌落。

在洗涤步骤中，轻轻上下振荡离心管，以确保洗涤液均匀地覆盖菌落。

7.离心细胞，以将液体与固体分离。

将离心条件设置为13,000×g，4°C，5分钟。

丢弃上清液。

8.重新悬浮菌落，使用约200-500µLSTET缓冲液，并轻轻振荡离心管，直到完全悬浮。

9. 取1.5 mL离心管中的样品，加入等体积的Lysis Buffer G2，并快速倒置混合，以完全裂解细胞，并将细胞内容物释放到溶解液中。

10. 加入等体积的N3 Buffer，并轻轻倒置混合，以中和裂解反应。

11. 加入等体积的G3 Buffer，并轻轻倒置混合。

此时，样品已经准备好进行DNA纯化。

请注意，上述步骤仅提供了OMEGA小提试剂盒提取质粒的基本步骤。

根据具体实验要求和试剂盒的使用说明，步骤可能会有所不同。

在开始实验之前，请仔细阅读并遵守试剂盒的使用说明。

omega质粒提取试剂盒原理
omega质粒提取试剂盒是一种快速提取质粒的试剂盒，原理基于离心法和碱裂解法。

质粒提取步骤如下：
1.细菌菌落挑选：选择莱茵氏或理光法制备的菌落，接种到含有复性2倍YT培养基中的管中，温育至15-18小时，使生长到中期即可。

2.洗涤菌体：离心收集菌体细胞，使用TE液洗涤菌体，通过离心去除菌体细胞内部的杂质。

3.裂解细胞：用离心的菌体用Alkali Lysis Buffer裂解细胞。

使得细胞壁和细胞膜破裂，游离出细菌的质粒和基因组DNA。

此时保持碱性能稳定质粒。

4.中和试剂添加：使用HCl溶液中和裂解碱的催化活性，维持实验体系pH值在7.0左右。

5.离心收集DNA：用NaCl把DNA从碱性溶液中析出，并通过离心将DNA沉淀下来。

6.洗涤DNA：用乙醇洗涤钠盐，去除残留的离子，甘油可保持溶液中的DNA
稳定性。

7.重悬质粒：将去除干扰物后的纯质粒在TE缓冲液中重悬，即可用于下一步实验。

BIOMIGA质粒小提试剂盒II简明步骤（PD1213）（详细内容请参考英文说明书）I. 实验前准备 II. 注意事项RNase A: 使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。

质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N1, 相同体积的Wash Buffer 和Elution Buffer. DNA Wash Buffer*: 使用前请将8 mL (PD1213-00)或48 mL (PD1213-01)或216 mL (PD1213-02) or 90 mL (PD1213-转化菌:若为-70oC 甘油冻存的菌，请先涂布平板培养03)96-100% 乙醇加入DNA Wash Buffer。

后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。

Buffer B1: 在低于室温时会沉淀，请于50oC左右水浴加热至沉切勿直接取冻存的菌种进行培养。

淀完全溶解，溶液澄清，使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。

在室温下（22-25oC）进行所有离心操作。

III. 操作步骤若用于提取1-5 mL的菌落，请将Buffer A1, B1, N1的量降低至250 μL, 250 μL 及350 μL，DNA wash Buffer及Elution Buffer的量不变。

1. 接种新鲜的单个菌落到5-12 mL的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时（勿超过16小时）。

2. 室温下10,000 x g离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。

注：残留的液体培养基容易导致菌体裂解不充分，第5步离心后沉淀较松，不易吸取上清。

注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD600（细菌密度）在之间的菌液。

若采用的是富集培养基，如TB或2×YT，注意保证OD600不超过。

质粒小提试剂盒提取质粒
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
（2）取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清；
（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
（4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；
（5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm离心10分钟，此时在离心管中底部形成沉淀；
（6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
（7）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
（8）重复操作步骤（8）；
（9）将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液除去；
（10）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。

质粒的提取
1、原理：破菌后，由于细菌基因组DNA和质粒的分子量及结构不一样，在不同pH状况下，可以将两者分离，然后进行纯化，就可以得到较纯的质粒。

2、质粒抽提步骤
（1）将带有质粒的E.coli接种于5ml LB、抗生素培养液中，37度摇床培养12-16h。

（2）取1.0-5.0ml的菌液，室温下10000×g离心1min收集菌液。

（3）倒弃培养基。

加入250μL Solution I/RNaseA混合液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。

（4）往重悬混合液中加入250μL Solution II,轻轻颠倒混匀4-6次。

此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5min。

（5）加入350μL Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。

（6）室温下，大于或等于10000×g离心10min。

（7）转移上清液至套有2ml收集管的Hi Bind DNA结合柱中，室温下，10000×g离心1min，倒去收集管中的滤液。

（8）把柱子重新装回收集管，加入500μL HB Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。

（9）把柱子重新装回收集管，加入700μL DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。

（10） (可选)弃去滤液，重复第9步骤一次。

（11）弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10000×g离心空柱2min 以甩干柱子基质。

（12）把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30-50μL Elution Buffer 到柱子基质中，静置1-2min，10000×g离心1min洗脱出DNA。

Omega 质粒小提试剂盒protocol主要试剂1. 使用前，将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。

2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存。

D6942-00: 加入6 ml无水乙醇D6942-01: 加入120 ml无水乙醇3. 按下表用异丙醇稀释HBC Buffer，并于室温保存。

D6942-00: 加入1.6 ml无水乙醇D6942-01: 加入16 ml无水乙醇D6942-02: 加入32 ml无水乙醇试剂配方及作用Solution I组分浓度25 mM Tris-HCl（pH8.0）,10 mM EDTA,50 mM 葡糖糖（Glucose）溶液1的主要作用是将菌体沉淀悬浮起来。

25mM Tris-HCl是缓冲溶液，保证反应体系的pH 恒定。

EDTA是金属离子螯合剂,10 mM EDTA的作用是与微生物体内的金属离子相互结合，抑制DNase的活性。

50 mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉降的时间。

溶液1在使用前通常要加入RNA酶（RNase A）,RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。

由于RNA酶属于蛋白质，蛋白质稳定性很差，所以加了RNase A的溶液1需要低温4℃保存。

Solution II组份浓度250 mM NaOH,1％（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠）溶液2的主要作用是细胞裂解。

溶液1将细胞悬浮后,就需要添加溶液2了,溶液2的作用就是对细胞进行裂解。

溶液2只包括两种成分：氢氧化钠和SDS。

真正起到到细胞裂解作用的是氢氧化钠,这也是为什么这个方法会被叫做碱裂解法。

氢氧化钠会破坏细胞膜的结构,使之发生bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化,从而导致细胞的裂解。

SDS的作用将在下一步提到。

添加溶液2后需要注意的一个是时间一定不能过长,另一个是不可以剧烈震动离心管。

时间过长以及剧烈震动都将导致氢氧化钠破坏基因组DNA,断裂的基因组DNA碎片将会与相似大小质粒一同被抽提,污染样品。

无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南（omega）详细内容：E.Z.N.A. ® Fastfiler Endo-free Plasmid MaxiprepProtocol(无内毒素质粒大抽提)1. 在1-4升的培养瓶中加入200-500ml LB培养基,然后加入菌种于37℃摇床培养12-16小时；Tip:为获得最好的结果，请接种1ml培养过夜的菌种（12-16hr）。

并强烈推荐使用E.coli(endA-)品系用于常规的质粒提取，如DH5a和JM109。

注意：菌液的培养时间不能超过16小时；2. 收集200ml培养基至适当的离心管，室温下，3,500-5,000×g离心10分钟沉淀；3. 吸尽并去除培养基，用干净的吸水纸吸尽壁上多余的液体。

加12.0ml Solution I/RNase A到细菌培养物中，涡旋和枪头抽打细菌以重悬细胞；注：充分重悬细菌沉淀物对获得高产量的质粒是相当关键的。

充分重悬后溶液是均匀的，不存在小块物质；请尽量吸弃残余的培养基以防止稀释加入的溶液；4. 加入12.0ml SolutionII，轻轻颠倒旋转混匀7-10次至获得澄清的裂解液；室温放置3-5分钟可以有是必须的。

避免剧烈振荡混匀而打断染色体DNA，降低质粒的纯度。

（Solution II使用后请盖紧盖子且于室温保存）；5. 将取出Lysate Clearance Filter Syrine活塞，将其放置于架子上；6. 加入12 ml Neutralization Buffer，轻轻颠倒混匀几次至出现絮状沉淀。

这可能需要放置2-3分钟并间断颠倒混匀；7. 立即将裂解液转移到lysate Clearance Filter Syrine中，垂直放置5分钟。

这时白色的絮状沉淀物会漂上溶液的上层，裂解液可能开始流出过滤器，用新的50ml管子收集细菌裂解液，并将活塞轻轻插入过滤器中；8. 握住过滤器，轻轻推动活塞将裂解液打到收集管中；注意不要将任何杂质打到收集管中；9. 加入0.1体积的ETR Solution（蓝色）到收集液中，轻轻颠倒旋转混匀7-10次，冰浴放置20分钟；注意：加入ERT Solution后，溶液应变得浑浊，但冰浴静置后溶液应是澄清的。

杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://EndoFree Plasmid Midi Kit无内毒素质粒小提中量快速提取试剂盒目录号：PL10试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次(PL1001)平衡液室温5mlRNaseA（10mg/ml）-20℃250µl溶液P1 4℃25 ml溶液P2 室温25 ml溶液N3 室温25 ml内毒素清除剂-20℃10 ml漂洗液WB 室温15 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温15ml吸附柱AC 室温50个收集管（2ml）室温50个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。

储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml）置于2-8℃保存。

如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。

2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。

也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

质粒提取试剂盒提取步骤
一、质粒抽提
1、细胞抽提：将细胞培养物加入或移植到一种含有高浓度酸性剂的6-8mm离心管里，将细胞离心至半浸没，以保持溶液沉积在离心管壁上。

2、除去膜：添加浓酸溶液（如硫酸氢钠（NaHSO3）），膜结构会被溶解，使其细胞表面的结构被破坏，从而除去细胞的膜。

3、去染色：添加RNA隔离试剂，脱去细胞染色物质以获得高纯度的RNA质粒。

4、离心：离心至接近干旱，并移除液体，这时的混合液中已只剩下RNA质粒。

5、抹拭：将离心管倒过来，将质粒在管壁上均匀抹拭，这时的RNA 质粒就会在管壁上附着。

6、冷冻干燥：将管子放到冰上，将管子中的水分蒸发冷冻干燥，使RNA质粒固定在管壁上。

7、溶解：最后，将RNA质粒溶解到可以用于后续实验的溶液中。

二、PCR扩增：
1、PCR建库：将抽提的DNA放入PCR管中，加入PCR反应混合液（包括DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2），并添加特长引物，即可进行PCR 反应。

2、PCR扩增：使用PCR反应温度循环加热并添加高分子量DNA来将DNA片段扩增。

3、电泳：将PCR配型片段送到电泳仪中，使用添加特异性引物的特定电泳条件，检测和鉴定基因突变。

OMEGA质粒提取试剂盒操作步骤1.预处理：将待测细菌液培养在含有适当抗性选择性的LB培养基中，并在适宜条件下培养至细菌达到对数期。

使用适当的离心参数和时间离心，使得细菌达到沉淀准备。

2.应激液制备：向OMEGA质粒提取试剂盒中的应激液瓶中加入8mL已过滤的异丙醇试剂A，并充分混合。

此时，应激液瓶中的液体会变成粉红色。

注意：应激液不能加入异丙醇试剂A之前。

3.柱洗液制备：向OMEGA质粒提取试剂盒中的柱洗液瓶中加入25mL已过滤的异丙醇试剂B，并充分混合。

此时，柱洗液瓶中的液体会变成黄色。

注意：柱洗液不能加入异丙醇试剂B之前。

4.提取液制备：将OMEGA质粒提取试剂盒中的提取液瓶取出，充分振荡混合，使其中的液体变为均匀的浑浊状态。

5.细菌沉淀：使用离心机将培养好的细菌培养物离心，设置好适当的离心参数和时间，使细菌达到沉淀。

6.破细胞：将上述离心后的细菌沉淀转移到50mL离心管中，加入10mL提取液，并用转粉棒均匀悬浮细菌。

细菌悬浮液较黏稠，加入提取液后需充分混匀。

7.混合物平衡：将OMEGA质粒提取试剂盒中的A离心管插入破细胞悬浮液，盖上盖子，轻轻翻转转动10次，使混合物均匀。

8.吸附：将A离心管放置于试剂离心机上，以最大转速离心3-5分钟，使质粒DNA吸附到离心管壁上。

离心后离心管内会有质粒DNA沉积在管壁上，上清液中几乎没有DNA。

9.液体除去：将上清液倒出（若有残留无形的DNA，不会影响测量质粒DNA浓度和纯度）。

10.洗涤：向吸附质粒DNA的A离心管中加入0.8mL柱洗液，并放入离心机中以最大转速离心1分钟将柱洗液完全通过。

注意：此步骤中重要的是将柱洗液完全通过以去除杂质。

11.干燥：向A离心管中加入0.8mL柱洗液（保险柱)，并通过离心室加热器以60℃加热干燥10-30分钟，使水分从柱中蒸发。

注意：此过程必须在脱水状态下进行。

12.质粒DNA洗脱：向A离心管中加入50μL的去离子水，并计时5分钟，使质粒DNA从固相柱上洗脱出来。

OMEGA试剂盒1、称量0.5g的玻璃珠（一盒试剂盒中的量可以均分为五份，一次一份），加入样品中，然后加入1ml Buffer SLX, 漩涡震荡5min。

（可借助漩涡震动仪）2、加入100微升DS Buffer混匀。

（可颠倒数次）3、70摄氏度水浴10min，上下颠倒混匀。

（70摄氏度为溶菌酶最适反应温度）（此时可准备后边要用的2ml EP 管，并准备后边冰浴要用的冰）4、3000rpm离心3min，取800微升上清至2ml EP 管，再加入270微升Buffer SP2 ，混匀。

5、冰浴5min，13000g，4摄氏度，5min。

6、转上清至2ml EP 管，加入0.7倍体积异丙醇，颤倒30次，混匀。

7、13000g，4摄氏度，10min，离心。

8、弃上清，倒置于滤纸上，空干。

（不一定非常干）9、加200微升Elution Buffer，吹打混匀，再65摄氏度水浴20min。

10、加70微升（50~100微升）HTR（由于该溶液颗粒较大，可用100微升枪头剪去部分尖端，用100微升量程取加），混匀10s，室温放置2min。

11、13000g，2min，吸取上清至新2ml EP 管中。

12、加入等体积XP2 Buffer混匀。

13、吸附柱套入收集管，样品倒入吸附柱，10000g 1min，弃废液，重新套入收集管。

14、加入700微升SPW，10000g 1min，弃废液，重新套入收集管。

15、重复14。

16、套入收集管，空管离心，条件13000g，2min。

17、取吸附柱套入1.5ml EP管，加入50微升Elution Buffer或者TE Buffer，60摄氏度水浴15min。

（60摄氏度时蛋白酶K最适反应温度）18、13000g离心1min。

19、重复17、18。

20、得到100微升。

近期使用可4摄氏度保存或者-20摄氏度。

OMEGA质粒提取试剂盒操作步骤1．在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的接种到5ml LB培养基LB（含氨苄青霉素50μg/ml），37℃振荡培养12-16h。

需特别指出的是：endA阴性的菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.2．取~5ml菌液室温10000×g离心1min3．去上清，加250µl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。

4．加入250µl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。

最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。

(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖)5．加350µl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀6. 室温13000×g离心10min.7．特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。

要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。

室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱8．弃滤过液，加500µl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。

如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略9．弃滤过液，再用100%乙醇稀释的700µl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min.注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签，如果经过冷冻，用前必须恢复室温10．此步可选：再加700µl Wash Buffer清洗吸收柱11.必须将吸收柱13000×g离心2min确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤。

12.将吸收柱放入干净离心管，加30-50µl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，13000×g离心1min，一次可洗脱75-80%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）。

E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒操作步骤GDS8000凝胶成像系统操作说明E.Z.N.A.试剂盒小提质粒2009-03-04 21:36:08| 分类：分子克隆|字号订阅1. 在无菌条件下，从转化成功的培养板上挑取单个菌落接种于5ml含有适当抗生素的LB液体培养基，37℃、约300rpm振荡培养12~16h。

2. 菌种的保存：取菌液1ml，加入0.5ml浓度为15-20%的灭菌甘油,混匀，分装于无菌的EP管中，冻存于-70℃。

将剩余菌液分装到2个EP管中，每管1.5ml菌液。

10000g 室温下离心1min，轻轻吸掉上清，尽可能吸尽。

3. 在EP管中各加入250μl Solution Ⅰ/RNase A，吹打（或涡旋）至细胞完全悬浮。

4. 加入250μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀数次（其间旋转EP管），得到澄清的裂解液。

然后温育2min（避免剧烈混合造成染色体DNA断裂以降低质粒纯度，裂解反应不能超过5min）5. Solution Ⅱ不用时应盖紧盖子，避免空气中CO2的酸化）。

6. 加入350μl Solution Ⅲ，立即上下颠倒数次直至白色絮状沉淀生产（混匀要完全、即时，避免局部出现沉淀）。

7. 室温下13000g离心10min，出现紧密的白色沉淀，立即进行下一步。

8. 将HiBind Miniprep Column柱装到2ml收集管中，小心吸取上清，加至柱子中，确保不要扰动沉淀，以免把细胞碎片带入柱子中。

室温下10000g离心1min，使裂解液完全过柱。

9. 移开柱子，弃去收集管中的液体，并将柱子重新插入收集管中，加入500μl Buffer HB，静置2min，10000g室温离心1min，使溶液完全过柱（此步骤确保残留的蛋白被除去）。

10. 弃去收集管中的液体，重新将柱子装好，加入700μl DNA Wash Buffer（加过无水乙醇的），静置2min，10000g室温离心1min使溶液完全过柱，弃掉收集管中的液体。

omega试剂盒提取质粒实验报告Omega试剂盒提取质粒实验报告1. 引言1.1 背景1.2 目的2. 实验设计2.1 实验材料2.2 实验步骤3. 实验结果与分析3.1 DNA浓度测定结果3.2 DNA纯度测定结果3.3 质粒提取效果评估4. 讨论与结论4.1 实验结果解读4.2 实验优化方向5. 参考文献1. 引言1.1 背景:质粒是一种环状的DNA分子，常用于基因工程和分子生物学研究中。

为了获得高质量的质粒DNA，常采用试剂盒提取方法。

Omega试剂盒是一种常用的质粒提取试剂盒，具有高效、快速、方便等优点。

1.2 目的:本实验旨在使用Omega试剂盒提取质粒，并评估其提取效果。

2. 实验设计2.1 实验材料:- Omega试剂盒- E.coli菌株含有目标质粒的培养物- TE缓冲液（pH=8）- 离心管- 离心机- 分光光度计2.2 实验步骤:1. 从含有目标质粒的E.coli培养物中取出1 mL菌液，离心10分钟（10000 rpm，4°C）。

2. 弃去上清液，加入适量的TE缓冲液悬浮细胞沉淀。

3. 加入Omega试剂盒提供的裂解缓冲液，并充分混匀。

4. 将混合物转移到Omega试剂盒提供的离心管中，并离心5分钟（12000 rpm，室温）。

5. 将上清转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，并轻轻倒置混匀。

6. 离心10分钟（12000 rpm，室温），将上清弃去。

7. 加入70%乙醇洗涤沉淀物，并再次离心5分钟（12000 rpm，室温）。

8. 弃去上清液，空气干燥沉淀物。

9. 加入适量的TE缓冲液重溶。

3. 实验结果与分析3.1 DNA浓度测定结果:使用分光光度计测定提取得到的质粒DNA溶液的吸光度，根据吸光度值计算DNA浓度。

3.2 DNA纯度测定结果:使用分光光度计测定提取得到的质粒DNA溶液的吸光度比值（A260/A280），判断DNA的纯度。

3.3 质粒提取效果评估:根据实验结果中所得到的DNA浓度和纯度，评估Omega试剂盒的质粒提取效果。

1用1."5 ml离心管收集1-5 ml菌液。

12,000 rpm离心1min，弃上清。

●应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。

菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化时会影响质粒纯度。

菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。

2加入250μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。

室温静臵1- 2min。

●初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。

可保存6个月。

●不要残留细小菌块。

菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。

●室温静臵1-2 min是为使溶液中的RNA被充分降解。

3加入250μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。

室温放臵1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

●若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解。

待恢复至室温后使用。

沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

●不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。

●此步骤不宜超过5 min。

4加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。

此时会出现白色絮状沉淀。

5 12,000 rpm室温离心10 min，收集上清。

6将上清臵于DNA纯化柱中，静臵1-2 min。

●如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（800μl），可将上清分次加入DNA纯化柱中。

7 12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

●此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。

8加入500μl溶液PB，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

●此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。

9加入500μl溶液W，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

●溶液W初次使用前用无水乙醇按1:1."5稀释，即含60%乙醇。

10加入500μl溶液W，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

11 12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。