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质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应 )在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA ，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A. 变性：加热反应系统至95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。
B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（ 35－70℃, 一般低于模板 Tm 值的 5℃左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。
C. 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq 酶作用下，以dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒 DNA 的提取与制备(1). 碱裂解法：染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异：A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 均变性；B. 当以高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2). 离心层析柱：A. 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA ，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。
3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 :DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰C. A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应DNA 的纯度；A260/A280=1.8DNA 纯净A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。
质粒D N A提取实验质粒DNA提取实验质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增②细菌菌体的裂解③质粒DNA的纯化一、材料与试剂准备1. 材料：大肠杆菌。
2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。
3. 试剂：（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。
（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。
（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。
（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。
（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。
二、实验步骤1.摇菌培养1）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。
2）置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。
3）灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。
4）挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。
5） 37℃，180rpm，振荡培养过夜。
2.收获细菌并裂解1）离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。
2）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。
3）细菌高速离心1min,彻底去除上清。
4）加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。
5）加入250ulLB溶液。
立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。
枯草芽孢杆菌质粒DNA的提取方法与PCR的设计班级：生物制药122 姓名：张泽伟学号：12243247一、枯草芽孢杆菌质粒DNA的提取1)菌体的培养与收集：挑取枯草芽孢杆菌的单菌落于2~10mlLB液体培养基中28~35℃振荡培养10~15小时，0.5~5wt%转接到40~150ml新鲜LB液体培养基中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD600＝0.5~1.2，收集40~150mg菌体于离心管中；2）原生体的制备：向收集的菌体中加入1~1.5ml预冷的洗涤液A悬浮细胞，离心弃上清，菌体重悬于200~300μl细胞裂解液B，37℃温育1.5~2h；3）细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的上述溶液中加入200~300μl溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100~150μl溶液D，轻轻混匀，于20℃中放20~30min；4℃离心，将上清液转移至新离心管内，加入无水乙醇，20℃过夜；4℃离心，弃上清，70wt%乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入无菌纯水溶解沉淀；4）质粒的纯化：将制备好的上述溶液转移到一个干净的离心管中，加入25倍体积DNA联接液E到离心管中，用手颠倒15分钟混匀；将联接混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置15分钟，3000~10000rpm离心1~3分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入联接混合液离心，直至所有联接混合液离心完毕；将含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入300~700μl洗涤液F到结合柱中，离心，倒掉收集管中的废液；将结合柱重新放回收集管，8000~18000rpm离心15分钟；将结合柱装入新的离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30~50μl洗脱液G，不戳破膜，室温放置，8000~15000rpm离心1~3分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于20℃；其中洗脱液G为0.1mM的HCl，pH=9.0。
