巨细胞病毒感染的检测及其研究进展

巨细胞病毒检测与鉴定研究进展微生物学免疫学进展2003年第31卷第2期巨细胞病毒检测与鉴定研究进展吴新刚综述;杨瑞馥审校(1.湖北郧阳医学院微生物学教研室,十堰442000;2.军事医学科学院微生物流行病研究所,北京100071)摘要:巨细胞病毒(CMV)多引起潜伏感染,而且其所致疾病的临床表现多为非特异性的,因此,建立早期快速,灵敏特异,可靠的检测和鉴定方法是至关重要的.本文从细胞培养,病毒抗原血症的检测,特异性抗体的检测和病毒核酸的检测四个方面就近年来CMV的检测和鉴定方法研究进展进行了简要的概述.关键词:巨细胞病毒(CMv);检测;鉴定中图分类号:R373.9文献标识码:A文章编号:1005—5673(2003)02—0066—05巨细胞病毒(Cytomegalovirus,,)是一类在自然界中普遍存在但又严格种属特异性的病毒,属疱疹病毒科.其中使人类致病的为人巨细胞病毒(HICMV),又名人疱疹病毒5型(HHV一5).HCMV在人群中的感染非常普遍,初次感染大多在2岁以下,除少数有临床症状外,通常呈隐性感染.人感染病毒后,多数可长期带毒成为潜伏感染.潜伏部位常在肾,唾液腺,乳腺及其他腺体中.在孕妇,原发或复发感染均可引起新生儿宫内感染或围产期感染,导致胎儿畸形,智力低下或发育迟缓等,严重者可引起全身性感染综合征,即巨细胞包涵体病.HCMV感染是导致免疫功能低下病人,尤其是HIV感染者,器官移植患者死亡的主要原因.长期以来,学者们在积极寻找高灵敏度,高特异性,快速,定量,早期,可靠的检测和鉴定方法.目前,HCMV的检测和鉴定方法主要包括以下几大类:细胞培养,病毒抗原血症的检测,特导性抗体的检测和病毒核酸(DNA及RNA)的检测.1细胞培养细胞培养是诊断HCMV感染的"金标准".传统的细胞培养方法是将尿液,唾液,血沉棕黄层等标本接种到单层人胚肺纤维母细胞上.在标准的试管细胞培养中,CMV会引起典型的细胞毒效应.这种效应的产生时间与样品中的病毒量有关,一般需2--21d(平均8d).病毒的定量一般根据蚀斑和TCIDso.尽管传统的病毒培养方法具有相当高的灵敏度和特异性,但它耗费大量的财力,物力和人收稿日期:2002_07_23作者简介:吴新1~(1977.),男,医学学士,助教,主要从事病原.微生物的检测.力,并且需要熟练的技术人员,因此,在临床上的应用受到了一定的限制L1】.在传统的细胞培养方法基础上,学者们发展了一种快速早期的检测技术即病毒壳脱落离心培养技术.该技术通过低速离心将标本接种于人胚肺成纤维细胞,培养24h后,用荧光标记的与HCMV即刻早期抗原有特异性反应的鼠单克隆抗体直接检测HCMV感染后表达的a,口蛋白.该方法通过维持接种常数及计算脱落壳感染病灶数来进行定量.它既保持了传统病毒培养的特异性,灵敏性,又加快了检测速度,一般24h即可检出【2】.但是,该方法的灵敏度会随标本保存时间的延长而降低,研究发现. 标本保存24h,其阳性率为44%--55%,而48h后再接种,其阳性率会下降到l0%.此外,其灵敏度会随该系统中多形核白细胞数量的增加而升高[3J. 但是,不管标本是保存于室温还是4℃,该方法的灵敏度不受影响.目前,该方法已得到了广泛的应用. Alexander等建立了一种新的微量病毒检测技术,即快速增强组织培养免疫荧光技术(Rapidan—hancedtissuecultureimmunofluorescence.RET—CIF).特异的细胞系培养于96孔微量板中,并向其中加入处理过的单克隆抗体,3298份标本接种后的3d即检出结果(92.5%);而病毒壳脱落离心培养技术需4.9d(87%).该方法适合大量临床标本的检测,它具有快速,灵敏,高分离率,省时的特点[4J.通过建立灵敏而特异的指示细胞系有利于微生物学免疫学进展2o03年第31卷第2期HCMV的快速检测和定量.Liu等通过将包含增强绿荧光蛋白报告基因(该基因受HCMVUL54启动子的调控)的表达盒导人雪貂肺细胞中,构建了一个稳定的指示细胞系,即ML-UL54.EGFP细胞系.使用该细胞系在感染后2d即能鉴定出HCMV.在荧光显微镜下可直接观察到EGFP阳性细胞,而通过流式细胞计数可对病毒进行定量.因此,使用该方法具有敏感,直接,廉价的优点L5J.2病毒抗原血症的检测最常用于检测的抗原为pp65,它是CMV活动性感染的早期标志物,由开放阅读框架UL82编码. 该方法的原理是用标记了荧光素或过氧化物酶的特异性单克隆抗体检测标本HCMVpp65.检测方法包括四个步骤:分离与制片,固定,免疫染色,阅读与定量.最常用的定量方法是报告每片的阳性细胞数或用于制片的每单位数量细胞的阳性细胞数;另一种方法是每片测定5万个细胞,计算其中的阳性细胞数.pp65病毒血症检测法是一种高灵敏度,高特异性的快速检测方法.一般3h即可出结果.研究表明,高pp65血症时有严重的临床症状;中度pp65 血症时,临床症状轻微;而低pp65血症时无症状.本法的缺点在于一旦使用抗病毒药物治疗,pp65阳性率及其含量会显着降低,尽管它仍会间歇升高.此外,本方法需要标本中有足够数量的粒细胞,所以在骨髓或干细胞移植后很难用该法进行HCMV的的早期检测L2J.此外也常以HCMV的即刻早期抗原(IEA),早期抗原(EA),晚期抗原(LA)作为HCMV感染的检测对象LoJo3特异性抗体的检测机体受到HCMV感染后,可产生lgM,lgG和lgA抗体.近二十年来的研究表明,CMV的主要免疫原性蛋白包括基质磷蛋白ppl50与pp65,主要DNA结合蛋白(p52),pp38,糖蛋白gB与gH等.其中gB和gH是诱发中和抗体产生的最常见的靶抗原;pp65,ppl50和pp38等具有非常强而持久的免疫原性,它们与病毒其他结构蛋白如pp52,pp72 等可能是造成恢复期患者抗体持续阳性的原因.目前,多主张采用上述抗原的重组蛋白或多肽作为抗原包被来检测CMV感染者血清中相应的特异性抗体.但Weber等通过使用不同的重组抗原的免疫酶试验(EIA)检测血清样本中的CMV抗体时发现, 采用重组抗原检测CMV活动性感染与采用天然抗原检测相比,其特异性和灵敏性并没有提高L7】.67常用的血清学方法有间接免疫荧光试验IF,间接血凝试验(IHA),放射免疫试验(RIA),免疫酶试验(EIA),Western印迹等,其中最常用的是EIA. EIA是以免疫学反应为基础,将抗原,抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来, 根据酶作用底物后显色,以颜色变化判断试验结果, 可经酶标测定仪作定量分析,敏感度可达ng水平. 但在EIA检测中,某些血清抗体与正常细胞抗原有非特异性反应而产生假阳性,若提高起始稀释度以排除假阳性又会降低实验的敏感性,故需做重复试验并设定正常细胞抗原对照.此外,结果可能受类风湿因子等干扰.Western印迹法检测HCMVlgM较EIA法具有更高的特异度.与病毒学检测结果相比,Western 印迹法的检测结果比EIA法具有更高的一致性(前者88.7%,后者67.5%)J.4ItCMV核酸的检测早期采用从临床标本中提取病毒DNA,电泳,转移及杂交等手段进行检测,但因灵敏度低,操作复杂未能推广应用.目前,广泛采用的方法有PCR扩增技术,杂交捕获技术,支链DNA信号扩增技术, 依赖核酸序列的扩增技术(NA)等.4.1P(,R扩增技术PCR扩增技术已得到广泛应用,尤其是在器官移植患者中.在临床上,PCR扩增技术已应用于血清,尿液,脑脊液,晶状体和玻璃体等标本中CMV的检测,标本冻存2y仍可检出阳性结果.它不仅能检测出CMVDNA,还能检测CMVRNA.PCR扩增技术具有极高的灵敏度和特异性,因此,PCR阴性即可否定CMV的感染,但是,PCR阳性不能分辨病毒处于复制状态还是潜伏状态.用于检测CMV的PCR方法大致包括定性PCR,半定量PCR,竞争PCR和非竞争定量PCR四大类.其差异主要存在于扩增程序,如目的序列的选择,引物的特性,扩增的循环,巢式PCR和对扩增子内源序列杂交的选择等.定性PCR具有极高的灵敏度,但无法分辨是潜伏感染还是活动性感染;定量PCR对确定感染的严重程度和预示患CMV病的危险度有帮助.目前,还没有确定哪类方案是具有最高灵敏度和特异度的最适方案【2J.现有的PCR引物设计大多根据CMV即刻早期基因的启动子和开始的4个外显子序列,晚期抗原(LA)gp64和磷酸化蛋白pp71基因序列.PCR检测的具体方法包括传统PCR,巢式PCR,多重PCR,定量PCR,实时荧光定量PCR,逆转录PCR等多种.目前研究较多的是多重PCR,逆转录PCR和实时荧光定量PCR.g.1.1多重PCR多重PCR,又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上2对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应. 多重PCR可在检测CMV的同时进行分型【9】.在此基础上发展起来的四重PCR在反应体系中加入针对4个不同基因序列的探针,检测受CMV感染的MRC-5细胞中CMVDNA,结果显示,其检测的特异度和灵敏度与加入1对探针的反应体系相同. 该方法的应用有利于变异株的检出H0}.g.1.2实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出. Funato等【lIJ首次将它应用于CMV的检测.他们应用双重荧光标记的特异性探针(两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团),以持家基因和fi-肌动蛋白基因作为目的序列,检测临床标本中的CMVDNA,结果表明,CMVDNA的拷贝数与CMV病的临床表现相关,提示实时定量PCR在检测,上具有临床应用价值.在此基础上发展起来的实时TaqMan定量PCR根据gB基因设计引物和探针,检测结果表明,pp65 检测结果与之有显着的相关性【I2】.而基于Light—Cycler的实时荧光定量PCR更表现出快速(1h内), 灵敏(检测下限<10拷贝/ml标本),定量范围广(2 ×10～2×10)等优点,而且已应用于多种类型临床标本中HCMV的检测和鉴定.该方法选择gB基因150bp的片段作为靶序列,逆转录探针标记了Cy5,序列特异性杂交探针3'端则标记了荧光素03}.g.1.3逆转录PCR(RT-PCR)RT-PCR是将RNA模板的反转录(I)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术.通过检测CMVmRNA可提示病毒的活动感染.可用于检测的mRNA包括剪接即刻早期mRNA和剪接晚期mRNA.由于剪接即刻早期mRNA在潜伏感染时也可能转录,因此更常用的是剪接晚期mRNA.Boriskin等[14】通过RT-PCR检测CMV剪接晚期RNAUL21.5,比检测DNA提前1～4w获得了阳性结果,而且该方法无需定量,可有效地反映病毒的活动性感染.但是, 通过常规RT-PCR,不易区分晚期mRNA和基因组DNA.此基础上发展的差异扩增PCR(DART- PCR)有效地克服了这一缺点.该方法的主要改进微生物学免疫学进展2o03年第3l卷第2期之处是使用不同的RT和PCR温度以及不同的RNA和DNA结构体系.Joo等[15】以HCMV gpUL55为靶序列对该方法进行的评估表明, DART-PCR无需分离DNA和RNA,可在一个管内同时检测DNA和RNA,并可进行定量.g.1.g连接依赖的PCR(Ligation.dependentPCR, U)_PCR)该方法的主要优点是可直接检测CMV感染细胞中而不是只含病毒DNA的上清液中的即刻早期mRNA.wu等[】使用该法检测临床标本中的CMV即刻早期mRNA,结果显示,31份阳性标本中18份培养阳性:一份阳性尿液标本培养为阴性;但有3份培养阳性标本LD-PCR检测为阴性. 提示,LD-PCR是一种可靠的检测CMV感染的方法.4.2杂交捕获技术(Hybridcaptureassay)这是一种通过RNA探针与病毒DNA杂交的溶液杂交抗体捕获技术.包含目的DNA的标本与特异的CMVRNA探针(该探针与,近40kb碱基对或17%的全基因组长度的碱基对互补)进行杂交,DNA:RNA杂交产物通过碱性磷酸酶偶联的特异性抗体捕获,化学发光底物进行定量.由于每38kb的杂交产物可与近1000个抗体结合,而每个抗体偶联有3个碱性磷酸酶分子,因此,结果被放大了至少3000倍.该方法有简单,快速的特点,它可在6h内获得结果.研究证实,白细胞高病毒含量与CMV病的发生有极强的关联.在判断CMV感染与严重的C病上,杂交捕获技术比PCR具有更高的特异性.此外,该方法受外源污染的影响小[17].4.3支链DNA信号扩增技术(BranchedDNAsig—halamplificationassay,bDNA)该方法是一种直接定量检测方法,它依赖bD—NA多聚体的信号放大,而不是目的序列的扩增.其关键在于构建特异性的探针.在反应体系中,共加入43对探针,9对介导CDNA与微孔板结合,34对介导CMVDNA和bDNA多聚体结合.每对探针包括能与CMV基因组gB或UL56区杂交的33对碱基序列,同时包括两种既能与捕获探针又能与bDNA多聚体杂交的18对碱基序列.该方法具有快速,灵敏的特点,而且重复性好,不受标本中其他病毒的影响.研究显示,阳性结果与活动性感染密切相关,不管是血清学阳性还是阴性的健康人, 其结果都是阴性.目前,该方法已用于外周血,脑脊液,精液等多种临床标本的检测[墙】.微生物学免疫学进展2003年第31卷第2期4.4依赖核酸序列的扩增技术(Nucleicacidse—quence-basedamplifictiontechnology,NASA) NASBA是199o年由Guatelli等建立的一种特异性的等温扩增技术,它能有效地鉴定多种类型临床标本中的CMV.该反应有赖于AMV逆转录酶.T7RNA多聚酶和核酸酶H共同协作而完成.在反应体系中,含有两种引物,引物I3'末端与靶序列互补,5'端含T7RNA多聚酶的启动子,这一引物用于合成eDNA;引物Ⅱ的碱基序列与cDNA的5' 末端互补.其基本原理是:在NASBA反应时,首先引物I与RNA模板复性,AMV逆转录酶催化合成cDNA,RNaseH水解eDNA上的RNA,形成一条单链的DNA;引物Ⅱ随即与此cDNA的5'未端结合,逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA 链.这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子.该酶即以此DNA为模板,转录出与样品RNA序列相同的RNA链,而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA.每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成eDNA.如此反复进行,将获得更多的RNA和cDNAMerlino等【19]采用NASBA技术检测肾移植患者血液标本中的pp65mRNA时发现,pp65抗原血症阳性的活动性HCMV感染者即使抗原血症水平低.pp65 mRNA检测仍有73.8%为阳性,其中21.4%的感染者,NASEIA技术比抗原血症检测法早6～15d即获得阳性结果.提示,NASBA技术在HC的活动感染的早期检测中具有重要的价值.Blok等(2o】用NASBA技术检测了HCMVpp67rnRNA,发现该方法比抗原血症检测法具有同样的特异性,而灵敏度较之更高.Greijer等【】在此基础上,建立了采用三种分子信标的多重实时NASBA技术(MR_NAS—BA).该技术能同时检测和定量即刻早期基因一1和UL65基因编码的IE-1和pp65mRNA.4.5电化学法检测扩增的CMVDNA产物CMV核酸扩增后,常采用琼脂糖凝胶电泳或比色杂交法进行检测,但其灵敏度有待进一步提高. Azek等(z2J首先采用电化学法进行检测,他们发现电化学法的灵敏度较琼脂糖凝胶电泳高23000倍, 较比色杂交法高出83倍.Authier~3】在此基础上进行了改进,建立了基于金微粒的电化学定量检测法. 其基本原理是:①单链目的CMVDNA与金微粒修饰的寡核苷酸探针结合;②通过氧化作用使结合在杂交产物上的Au释放到溶液内;③在一个夹心式丝网印刷微条电极(Sandwich—typescreen—printed microbandelectrode,SPMBE)上通过溶出伏安法间接测定溶解的Au3离子.由于电极沉积期内Au3质量转移的增加呈非线性,因此SPMBE能够灵敏的检测出静态液体中Au".研究证实,该方法可检测出5pM的CMVDNA扩增产物.4.6分子杂交技术IE-1是CMV进入宿主细胞后最先表达的基因,并且它的表达不需要病毒蛋白的参与,因此IE- 1可望作为特异性的探针来检测CMVmRNA.Wu 等【]构建一种链特异性32p或地高辛标记的探针, 该探针来源于HCMVIE-1基因的特异性外显子序列.通过Southem印迹和RNA原位杂交,在HCMV感染的容许细胞(人纤维原细胞)和非容许细胞(鼠纤维原细胞)均可检测阳性结果.结果显示,直接检测IE-I转录的RNA原位杂交技术是检测CMV早期感染的有效方法.综上所述,尽管病毒壳脱落离心培养技术得到了极其广泛的应用,但其耗时较长,结果受标本保存时间影响较大,所以其临床应用价值尚不明朗.血清学试验由于只能在感染2～4w后才能检出阳性结果,而且不能分辨潜伏感染和活动性感染,其临床应用价值受到了一定的限制.抗原血症检测技术是一种更快速,更灵敏,早期检测CMV活动性感染的技术,但一旦使用抗病毒药物治疗,其灵敏度会受到影响.分子生物学技术的发展则提供了更灵敏的早期检测工具.在出现临床症状以前,抗原血症检测技术和PCR技术均可检测和鉴定出CMV的感染.参考文献:[1]SiaIG,PatelR.Newstrategiesforpreventionandtherapyofey—tomegalovirusinfectionanddiseaseinsolid-organtransplantred#一eros[J).ClinMicrobiolRev2000,13(1):83—121.[2]BoeckhM,BoivinG.Quantitationofcytcm~egalovim:method—ologicaspectsandclinicalapplications[J].ClinMicrobiolRev 1998,11(3):533—554.[3]LandryML,CohenS,l~sonofEDTAandacid—citrat~dextrosecollectiontubesfordetectionofcytomegalovims antigenemiaandinfectivityinleukocytesbeforeandafterstorage [J].JClinMierobiol1997,35(1):305—306.[4]AlexanderR,LambD,~VhiteD,eta1.'RE-'TCIF:arapid,sen—sitivemethodfordetectionofviruses,applicableforlargema'abers ofclinicalsamp1es【J].Jvim1Methods2001,97(1-2):77—85. [59LiuWT,SunJR,LinCH,eta1.Anindicatorcellassayforde—tectionofhumaneyt~negalovrusbasedOnmhaneedgreenfluores- centprotein[J).JvimlMethods2001,96(1):85—92.[6]KalicinskiP,KaminskiA,ProkuratA,eta1.Disandmoll—itofingofcytomegalovirnsinfectionafterlivertransplantationinchil&en(J].AnnTransplant1996,1(2):13—14.70[7]WeberB,BelierA,Rfl~lauH,eta1.Humaneyt~egalovirus infection:diagnosticpotentialofreoombinantantigensforey—tomegalovirmantibodydetection[J].JvimlMethods2001,96 (2):157—170.[83I~rottoT,MaineGr,MontePD,eta1.DetectionofSe姗immonoglobulinM幻humancytomegalovirusbywesternblotting correlatesbetterwithvirologicaldatathandetectionbyoonven—tionalerlzymeimmunoassay[J].ClinLabImmunol1996,3 (5):597.60o.[9]PoloF.TenorioA.Detectionandtypingoflymphotropicher. pesvibymultiplexpolymerasechainreaction[J].JvimlMethods1999.79(1):9.19.[10]MarkoulatosP,S{lm锄V,SiafakasN,eta1.Developmentofa quadriplexpolymerasechainreactionforhumancytomegalovirus detection[J].JClinLabAnal1999,13(3):99—105.[11)FunatoT,satohJ,sa-sakT.QuantitativePCRsystem[J].Rin. shoByori1998.46(5):399—405.[12]GuiverM,foxAJ,MuttonK.eta1.EvaluationofCMVviral loadusingtaqmanCMVquantiativePCRandcomparisonwith CMV antigeno~iaheartandlungtransplantrecipients[J]. Transplantation2001,71(11):1609—1615.[13]KcarnsAM.TurnerAJL.EltringhamGJA,eta1.Rapiddetec—tionandquantificationofCMVDNAinurineusingLightcyclerTM-basedrcal-timePCR[J].JClinVirol2002,24(1—2):l31. 134.(14]BoriskinYS,FullerK.PowlesRL.eta1.Earlydetectionofcy—tomegaiovirus(CMV)irdeetioninbonen盯owtransplantpa—tientsbyreversetranscriptionPCRforCMVsplicedlategeneUL21.5:atwositeevaluation[J].JClinviro12002,24(1—2): 13.23.[15]JooCH,LeeH,KimE,eta1.Differentialampli协ngRT-PCR: al'lOvelIr.f)CRmethodtodifferentiatemRNAfromitsDNA lackingintron[J].JⅥrolMethods2002,100(1-2):711.[16][17][18][19][203[21][22][23][24]微生物学免疫学进展2oo3年第3l卷第2期W_uF,LiH,ZhangDY.Differemialdetectionofey- tomegalovirusimmediate-earlym∞sen蚪IAinclinical$flln—piesusingligation.dependentPCR[J].MolDiagn2001.6(4): 233—239.BhoradeSM,Sandes~raC,GarrityED,eta1.Quantificationof eytcmegalovirus(CMV)virall0adbyhybridcaptureassayallows forearlydetectionofCMVdiseaseinlungtransplantrecipients [J].JHeartLungTransplant2001.20(9):928—934. NolteFS.BranchedDNAsignalamplificationfordirectquamita- tionofnucleicacidsequencesinclinicalspecirne~[J].AdvClin Chem1998,33:201-235.MerlinoC,BergalloM,GregoriG,eta1.HCMVpp67一mRNA detectionbynucleicacidsequence-basedamplificationinrenaltransplantpatients[J].NewMierobiol2002,25(1):1-8.BlokMJ,(舢VJ,V anherleSJ,eta1.Diagnosticvalueof monitoringhumancytomegaloviruslatepp67mRNAexpression inrenal—allograftrecipientsbynucle;acidsequence-~ampli—fication[J].JClinMierobiol1998.36(5):1341.1346. GreijerAE.AdriaameHM,DekkersCA.eta1.Multiplexreal—timeNASBAformonitoringexpressiondynamicsofhumancy—tomegalovirusencodedIE1andpp67RNA[J].JClinviml20o2.24(1-2):57—66,AzekF,GrossiordC,Joa~esM,eta1.Hybridizationassayat disposableelectrochemicalbiosensorfortheattomoledetectionof amplifiedhumancytomegalovirusDNA[J].AnalBioehem2000, 284(1):107一l13,AuthierL,GrossiordC,BrossierP.Goldnanoparticle-based quantitativeelectrolch~nicaldetectionofamplifiedhumancy—tomegalovirusDNAusingdisposablemicrobandelectrodes[J]. AnalChem2001.73(18):4450.4456..WuTC,Fuente~BermrdoDA,ChartYJ.eta1.Detectionof thehumancyttm~egalovirus2.0一kbimmediateearlygene1tram—scriptsinpermissiveandnonpermissiveirdectionsbyRNAinsitu hybridization[J].JBiomedSci1997.4(1):19-27.。

实时荧光定量PCR检测人巨细胞病毒感染的临床意义分析实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测技术，可以用于检测病毒感染。

人巨细胞病毒（HCMV）是一种广泛存在于人群中的病毒，它可以引起免疫功能低下人群的严重感染。

本文将通过对实时荧光定量PCR检测人巨细胞病毒感染的临床意义进行分析，以期探讨该技术在临床诊断和治疗中的应用前景。

一、HCMV感染与临床疾病HCMV感染是一种全球性分布的病毒性感染，通常对健康人群并不产生严重影响，但对于免疫功能低下的人群，特别是器官移植受者、艾滋病患者和先天免疫缺陷患者等，HCMV感染可能导致严重并发症，如肺炎、肝炎、胃肠道炎症等。

HCMV还是新生儿感染的主要致病因子之一，导致新生儿先天性HCMV感染，可能引发先天性畸形和神经系统损伤。

二、实时荧光定量PCR检测HCMV感染1. 技术原理实时荧光定量PCR是一种核酸扩增技术，它结合了PCR扩增和荧光探针技术，能够实现对靶基因数量的准确计数。

在进行PCR扩增的荧光探针与靶基因结合，产生特定的荧光信号，通过荧光信号的强度可以定量检测靶基因的数量。

实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高准确性和高特异性的特点，能够快速准确地检测HCMV感染。

2. 临床应用实时荧光定量PCR检测HCMV感染已被广泛应用于临床诊断和监测。

在器官移植术后感染HCMV的患者中，通过定期对血液或组织样本进行实时荧光定量PCR检测，可以及时发现HCMV感染的情况，以便早期干预治疗。

对于新生儿先天性HCMV感染的诊断，实时荧光定量PCR也具有高度的准确性和可靠性，有助于早期发现感染，进行及时治疗。

1. 提高诊断准确性传统的HCMV感染诊断方法包括病毒培养、免疫组化检测和血清学检测等，这些方法存在着时间长、操作复杂、准确性低等缺点。

而实时荧光定量PCR检测HCMV感染具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，能够在短时间内对HCMV感染进行快速、准确的诊断，有助于提高诊断准确性。

实时荧光定量PCR检测人巨细胞病毒感染的临床意义分析1. 引言1.1 背景介绍人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）是一种广泛存在于人类群体中的病原体，属于疱疹病毒科。

HCMV感染在全球范围内具有高发病率，尤其是在免疫功能受损的个体中，如艾滋病毒感染者、器官移植患者和新生儿等。

HCMV感染对人类健康造成了一定的威胁，容易引起各种严重疾病，包括肺炎、胃肠道炎、感染性单核细胞增多症等。

实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏、高特异、快速、准确的核酸检测技术，已被广泛用于病原体的检测和定量。

在HCMV感染的检测中，实时荧光定量PCR技术具有极大的优势，能够快速准确地检测出病毒的存在和数量，为临床诊断和治疗提供了重要依据。

本文将对实时荧光定量PCR技术进行介绍，探讨HCMV感染及其危害，分析实时荧光定量PCR在HCMV感染检测中的应用，进一步探讨其临床意义，并对检测结果进行解读，以期为临床诊疗提供科学依据和参考。

1.2 研究目的研究目的是探讨实时荧光定量PCR技术在检测人巨细胞病毒感染中的应用及临床意义，为临床诊断和治疗提供可靠依据。

具体目的包括：1.了解实时荧光定量PCR技术的原理和方法，探讨其在人巨细胞病毒感染检测中的优势和局限性。

2.分析人巨细胞病毒感染的病原学特点及危害，探讨实时荧光定量PCR在早期诊断和治疗中的应用潜力。

3.总结实时荧光定量PCR检测人巨细胞病毒感染的临床意义，探讨其在指导临床决策、评估疗效和预后预测方面的作用。

4.通过对检测结果的解读，分析实时荧光定量PCR在人巨细胞病毒感染监测中的可靠性，并提出进一步研究的展望和建议。

通过本研究，旨在为临床医生提供更准确、快速和可靠的人巨细胞病毒感染检测方法，为患者的诊断和治疗提供更好的支持。

2. 正文2.1 实时荧光定量PCR技术介绍实时荧光定量PCR是一种高度灵敏和特异性的分子生物学技术，可用于快速、准确地检测目标DNA或RNA序列的数量。

巨细胞病毒研究进展巨细胞病毒是一种病毒，它们的特点是在感染宿主细胞后可以引起宿主细胞体积增大，甚至形成多核巨细胞。

巨细胞病毒已知具有广泛的宿主范围，其中包括人类、动物和植物。

巨细胞病毒感染可以引起多种疾病，包括人类巨细胞病毒感染导致的卡普西氏肉瘤、鸟类的诺卡氏病、食蚜虫的病毒感染等等。

研究表明，巨细胞病毒可能具有潜在的抗肿瘤作用，因此引起了学术界的极大兴趣。

本文将简要介绍巨细胞病毒的研究进展。

1.巨细胞病毒的分类巨细胞病毒是一类群体感染的DNA病毒，它们都具有一个共同的特点，那就是在宿主细胞内形成多核细胞。

根据巨细胞病毒的宿主范围和生物学特性，巨细胞病毒可以分为4个科：痘病毒科、腺病毒科、巨细胞病毒科和赤病毒科。

其中，病毒科和腺病毒科是两个针对哺乳动物的病毒科，赤病毒科是一类紫外线感光的DNA病毒，只在昆虫中发现。

2.巨细胞病毒与肿瘤的关系近年来，人们对巨细胞病毒的研究逐渐深入，人们发现，巨细胞病毒可以感染肿瘤细胞，并且病毒的感染可以诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤的生长和扩散。

在人类体内，巨细胞病毒的感染与卡普西氏肉瘤的发生有一定关系。

研究表明，80%的卡普西氏肉瘤与人类巨细胞病毒感染有关。

另外，许多研究都表明，许多种植物巨细胞病毒对肿瘤的治疗有着重要的作用。

3.巨细胞病毒的基因组研究与进化巨细胞病毒的基因组流失，解析其基因组观察到巨细胞病毒的基因组结构不规则，有大量的终止密码子和垃圾碱基，这些特点表明巨细胞病毒的基因组流失与细胞合作的程度密切相关。

随着基因组学技术的发展，越来越多的巨细胞病毒基因组被测序，其进化与演化关系也逐渐被揭示。

研究表明，巨细胞病毒的基因组在进化过程中存在着盗贼RNA和转座子的活跃性，这可能是巨细胞病毒基因组结构不断变化的原因。

4.巨细胞病毒感染宿主细胞机制的研究巨细胞病毒感染机制的研究是病毒生物学领域的一个热点。

巨细胞病毒的感染过程包括病毒进入宿主细胞、病毒基因组的复制和表达、以及病毒颗粒的组装和释放等阶段。

新生儿人巨细胞病毒感染的实验室诊断研究进展作者：王帅来源：《中国当代医药》2012年第29期[摘要] 新生儿巨细胞病毒性疾病是一种新生儿常见疾病，因其发病隐匿，故临床上以实验室检测为诊断疾病的关键。

本文综述了实验室常用的检测方法，比较了各种检测方法的利弊及临床的应用状况和前景，为医生合理地诊断新生儿巨细胞病毒性疾病提供参考。

[关键词] 巨细胞病毒感染；新生儿；pp65抗原血症；研究进展[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）10（b）-0017-02新生儿巨细胞病毒性疾病是由人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染所引起的一种疾病，新生儿因免疫系统尚未发育完全，机体抵抗HCMV的入侵能力极弱，很容易形成HCMV活动性感染。

2004年的统计学研究报道，新生儿的HCMV平均感染率接近10%，病死率接近20%；其余感染患儿可出现中枢神经系统损害、颅骨发育畸形、发育迟缓等症状[1-3]。

因HCMV感染无特异的临床症状和体征，而且患儿多因免疫系统发育不完全而表现为隐性感染，故如何准确、快速、特异性地检测到早期HCMV活动性感染成为临床治疗的关键。

1 病毒分离病毒分离法一直被认为是诊断HCMV活动性感可靠性和特异性最强的方法。

利用免疫标技术检测病毒抗原可缩短病毒检测时间至24～48 h。

常采用尿样本，也可取体液和组织样本[4-5]。

该方法将尿、脐血等检测标本与人胚成纤维（HF）细胞共同孵育，在培养1～3周后，观察HF细胞有无出现致细胞病变效应。

但由于HCMV在体外生长速度缓慢，检测时间长，不能快速确诊以满足临床需要，故该法主要应用于科研[3]。

2 血清特异性抗体检测新生儿HCMV感染后可刺激人体产生体液免疫反应，因此，通过ELISA法检测血清中特异性HCMV-IgM、HCMV-IgG抗体可间接证实体内是否有HCMV感染。

其中，血清IgM抗体因发生于感染早期，故IgM抗体阳性被认为是HCMV活动性感染的指标；而血清IgG抗体阳性则表明患儿曾有HCMV感染史[6]，若HCMV-IgG滴度升高4倍以上则提示有HCMV活动性感染。

实时荧光定量PCR检测人巨细胞病毒感染的临床意义分析【摘要】本文旨在探讨实时荧光定量PCR在检测人巨细胞病毒感染中的临床意义。

首先介绍PCR技术在临床诊断中的应用，然后解析实时荧光定量PCR的原理。

人巨细胞病毒感染的临床表现被详细描述，接着介绍实时荧光定量PCR检测该病毒感染的方法。

实验结果分析将进一步探讨该技术在病毒检测中的重要性。

结论部分将总结实时荧光定量PCR在人巨细胞病毒感染诊断中的临床意义，并展望未来的研究方向。

本研究旨在为临床医生提供更准确、快速的诊断手段，帮助早期干预和治疗人巨细胞病毒感染。

【关键词】实时荧光定量PCR、人巨细胞病毒、临床意义、PCR技术、临床诊断、原理、临床表现、方法、实验结果、结果分析、结论、未来研究方向、总结。

1. 引言1.1 背景介绍巨细胞病毒（CMV）是一种普遍存在于人类中的病毒，感染率随年龄增长逐渐增高。

在免疫功能正常的人群中，CMV感染通常无症状或仅产生轻微的症状，但在免疫功能受损的人群中，如HIV感染者、器官移植患者、白血病患者等，CMV感染可引起严重的并发症，甚至危及生命。

实时荧光定量PCR作为PCR技术的一种变种，通过在PCR反应过程中监测产生的DNA扩增产物的实时荧光信号来实现对目标DNA的定量检测，具有高度的灵敏度和特异性。

利用实时荧光定量PCR技术检测人巨细胞病毒感染具有重要的临床意义，可以根据检测结果及时进行诊断和治疗，降低感染带来的风险。

本研究旨在探讨实时荧光定量PCR技术在人CMV感染诊断中的应用，为临床提供更准确、快速的诊断手段。

1.2 研究目的我们的研究旨在验证实时荧光定量PCR技术在人巨细胞病毒感染检测中的准确性和可靠性，并探讨其在临床诊断中的实际意义。

通过本研究，我们希望可以为提高人巨细胞病毒感染的早期检测率、准确性和治疗效果提供科学依据，为临床医生在诊疗工作中提供更好的支持和指导。

我们也希望能够为今后相关疾病的研究提供启示，推动相关领域的发展与进步。

实时荧光定量PCR检测人巨细胞病毒感染的临床意义分析引言人巨细胞病毒（HCMV）是一种广泛存在于人类群体中的病毒，几乎所有的成年人都曾经感染过HCMV。

尽管大多数感染者没有症状，但在免疫功能受损的患者中，HCMV感染会引起严重的并发症，包括肺炎、脑炎、视网膜炎等。

对于免疫功能受损的患者来说，及时准确地检测HCMV感染非常重要。

实时荧光定量PCR技术已经成为检测HCMV感染的主要方法之一，本文将对其临床意义进行分析。

一、实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度和高特异性的核酸检测方法，通过扩增目标DNA序列并实时监测PCR反应过程中的荧光信号来进行定量分析。

相比传统的PCR方法，实时荧光定量PCR技术具有检测快速、准确性高、可靠性强等优点，已经在临床诊断中得到广泛应用。

二、实时荧光定量PCR检测HCMV感染的临床意义1. 提高早期诊断率HCMV感染在免疫功能受损的患者中容易引起严重的并发症，因此早期诊断对于及时采取治疗措施非常重要。

实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度和特异性，可以检测到病毒感染的早期病毒载量，有助于提高早期诊断率，为及时治疗提供重要的依据。

2. 监测治疗效果对于HCMV感染的治疗过程中，实时荧光定量PCR技术可以实时监测病毒载量的变化，评估治疗效果。

通过定期检测HCMV病毒载量的变化，可以及时调整治疗方案，提高治疗效果，减少治疗过程中的并发症和副作用。

3. 提高预后评估的准确性HCMV感染在免疫功能受损的患者中往往会导致严重的并发症，严重影响患者的预后。

实时荧光定量PCR技术可以对HCMV病毒载量进行定量分析，为预后评估提供更为准确的依据。

通过监测病毒载量的变化，可以及时发现预后不良的患者，采取更加积极有效的治疗措施。

4. 指导预防措施的实施对于接受器官移植、造血干细胞移植等免疫抑制治疗的患者，预防HCMV感染尤为重要。

实时荧光定量PCR技术可以对HCMV感染进行早期监测，及时发现感染者，以指导预防措施的实施。

实时荧光定量PCR检测人巨细胞病毒感染的临床意义分析1. 引言1.1 研究背景人巨细胞病毒是一种广泛存在于人类群体中的常见病毒，主要通过呼吸道、唾液等途径传播，在全球范围内都有较高的感染率。

人巨细胞病毒感染可以引起一系列不同严重程度的疾病，如呼吸道感染、消化系统感染、神经系统感染等，对特定人群，如免疫功能低下的患者、新生儿和儿童等，病情可能会更加严重甚至威胁生命。

传统的人巨细胞病毒感染检测方法包括细胞培养、免疫荧光等，然而这些方法存在着检测灵敏度低、耗时长、操作复杂等缺点。

迫切需要一种快速、准确且高灵敏度的检测方法来及时诊断人巨细胞病毒感染，以指导临床治疗和预防控制措施的制定。

1.2 研究目的本研究旨在通过实时荧光定量PCR技术对人巨细胞病毒感染进行准确、快速的检测和定量分析，深入探讨该技术在人巨细胞病毒感染诊断中的应用潜力以及临床意义。

具体目的包括：1. 探究实时荧光定量PCR技术在人巨细胞病毒感染检测中的灵敏度和特异性，评估其在临床诊断中的准确性和可靠性。

2. 分析人巨细胞病毒感染的临床表现特点，探讨实时荧光定量PCR技术在早期诊断和治疗监测中的应用前景。

3. 探讨实时荧光定量PCR技术在人巨细胞病毒感染预防、控制和治疗中的临床意义，促进相关疾病的早期诊断和有效治疗。

通过对以上目的的研究，本研究旨在为人巨细胞病毒感染的临床诊断和治疗提供科学依据，并为相关疾病的防控工作提供技术支持和指导。

1.3 研究意义本研究的意义在于提高人巨细胞病毒感染的诊断准确性和效率，从而为临床治疗和预防提供更科学的依据。

目前，传统的检测方法存在着准确性低、耗时长、操作复杂等缺点，而实时荧光定量PCR技术具有高度灵敏性、特异性和快速性的优势，可以在短时间内准确检测出病毒感染情况，为疾病的早期筛查和诊断提供重要依据。

通过该技术的应用，可以对病情的发展和治疗效果进行动态监测，为临床医生调整治疗方案提供实时数据支持。

本研究的意义在于推动人巨细胞病毒感染的诊断技术的进步，为改善患者的治疗效果和生存质量做出贡献。

cmv诊断鉴别方法CMV（巨细胞病毒）是一种常见的病毒感染，在临床上具有重要意义。

为了能够有效地诊断和鉴别CMV感染，医生需要采用多种方法和检查手段。

本文将介绍CMV的诊断鉴别方法，包括临床观察、实验室检查、病毒分离和抗原抗体检测等。

一、临床观察临床观察是CMV感染最基本的诊断方法，通过对患者的症状、体征和病情进展的观察，可以初步判断是否为CMV感染。

CMV感染通常表现为发热、皮疹、淋巴结肿大、肝脾肿大等，但这些症状和体征也可能出现在其他病毒感染或细菌感染中，因此临床观察只能作为初步判断。

二、实验室检查1. 病毒分离病毒分离是诊断CMV感染最可靠的方法之一，可以从患者的体液或组织中分离出CMV病毒。

通过将患者的样本接种到特定的细胞培养中，观察病毒感染细胞的生长和病变，可以确定是否为CMV感染。

但病毒分离技术复杂，时间长，成本高，一般只用于特殊病例。

2. 抗原检测抗原检测是检测CMV病毒的抗原成分，常用的方法包括免疫荧光法和ELISA法等。

抗原检测可以快速检测患者体内的CMV抗体或抗原水平，帮助医生判断病情和制定治疗方案。

对于早期诊断和治疗效果的评估，抗原检测具有重要意义。

3. 抗体检测抗体检测是检测患者体内是否感染过CMV的证据，常用的方法包括IgM和IgG抗体检测。

CMV感染后，人体通常会产生IgG和IgM两种抗体，但不同时间的抗体水平不同，可以用于评估感染的时间和病情进展。

抗体检测结果可以帮助医生判断患者是否为近期感染，以及是否需要进一步治疗。

三、影像学检查影像学检查对于CMV感染的诊断和鉴别也有重要意义。

常用的影像学检查方法包括X线、CT、MRI等，可以帮助医生了解患者感染部位的病变情况，如肝脏、脾脏、淋巴结等。

对于疑似中枢神经系统感染的患者，影像学检查还可以帮助医生评估病情和制定治疗方案。

四、鉴别诊断CMV感染需要与其他病毒感染和细菌感染进行鉴别诊断，如疱疹病毒感染、EB病毒感染、肝炎病毒感染等。

PCR法检测CMV概述PCR（聚合酶链反应）是一种常用的检测方法，用于检测细菌、病毒和遗传物质等。

CMV（巨细胞病毒）是一种广泛存在于人体中的病毒，与多种疾病有关。

本文将介绍使用PCR法检测CMV的步骤和重要注意事项。

步骤下面是使用PCR法检测CMV的一般步骤：1. 样本收集：从患者体内收集合适的样本，例如血液、唾液或尿液。

2. DNA提取：从样本中提取CMV的DNA，可以使用商业化的DNA提取试剂盒。

3. PCR反应混合物准备：将所提取的DNA与PCR反应所需的试剂混合，包括引物（用于指定检测目标的DNA片段）和聚合酶等。

4. PCR扩增反应：将反应混合物放入PCR仪器，并按照指定的温度和时间条件进行扩增反应。

这可以通过不断变化温度进行的循环进行。

5. PCR产物分析：利用凝胶电泳等方法，分析PCR反应产物，在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，可见特定大小的DNA片段。

6. 结果分析：根据分析PCR产物的大小来确定CMV的存在。

如果特定大小的DNA片段出现，说明样本中存在CMV。

注意事项在使用PCR法检测CMV时，需要注意以下事项：1. 样本采集和处理应当遵守严格的无菌操作规范，以避免外来DNA的污染。

2. PCR反应中的试剂和仪器应当准备充分，并且保持合适的温度和时间条件。

3. 引物的选择非常重要，应当确保其能够特异性地识别CMV 的DNA片段。

4. 对PCR反应产物进行准确的分析和解读，以避免误判。

总结PCR法是一种可靠和高效的方法，用于检测CMV。

通过遵循正确的步骤和注意事项，可以得出准确的结果。

这对于预防和诊断与CMV相关的疾病非常重要。